Необходимость моделирования венозного тромбоза в эксперименте чаще всего связана с изучением антитромботической активности различных лекарственных веществ и эффективности различных хирургических манипуляций. Для этих целей исследователи в основном используют метод S. Wessler и соавт. [1] (сочетание застоя и гиперкоагуляции) в различных его модификациях. В классической модели S. Wessler и соавт. [1] на кроликах состояние гиперкоагуляции достигают за счет введения гетерологичной сыворотки (например, сыворотки крови человека) или активированного фактора свертывания, после чего создается венозный стаз.

Позже была показана возможность использования этого метода на других животных (собаках и крысах) и с другими агентами, активирующими тромбообразование. В частности, J. Herbert и соавт. [2] вызывали венозный тромбоз перевязкой нижней полой вены у крыс с предварительным внутривенным введением тканевого тромбопластина. L. Kaptanoglu и соавт. [3] формировали тромб в эксперименте на крысах в области брюшной нижней полой вены также с помощью метода S. Wessler.

Н.Н. Дрозд и соавт. [4, 5] через определенные промежутки после введения исследуемого антитромботического вещества активировали систему свертывания сывороткой человека. Затем перевязывали сантиметровый участок вены, которую не использовали для введения веществ.

Для создания венозного тромбоза также применяют только перевязку венозного ствола или установку на него зажима [6-16].

J. Zhou и соавт. [17] для получения тромбоза нижней полой вены у крыс осуществляли ее перевязку на время от 15 до 60 мин. Лигирование приводило к быстрой дилатации нижней полой вены, и через 60 мин тромбы были обнаружены у всех крыс. Небольшие тромбы были обнаружены у большинства животных уже через 15 мин после перевязки. Тромбы были богаты фибрином с агрегированными тромбоцитами, с лейкоцитами и эритроцитами. Большинство тромбов возникало на месте повреждения эндотелия. Иммуногистохимический анализ показал экспрессию тканевого фактора эндотелиальными клетками и лейкоцитами.

В литературе [18, 19] имеются рекомендации частичной перевязки магистральной вены. P. Pottier и соавт. [20] разработали первую модель на животных, в которой венозный застой может быть откалиброван путем изменения степени стеноза нижней полой вены. В модели присутствует предварительное тромботическое состояние у крыс, созданное за счет частичной перевязки нижней полой вены.

И.С. Иванов и соавт. [21] в своих исследованиях применяли метод, описанный I. Reyers и соавт. [22]. Для этого животных подвергали наркозу (внутрибрюшинно уретан, 1 г/кг), вскрывали брюшную полость, выделяли полую вену и перевязывали ее хлопковой нитью дистальнее левой почечной вены. После чего брюшную полость послойно ушивали. Через 2 ч проводили лапаротомию, участок вены длиной 7 мм иссекали. Тромб выделяли из просвета сосуда, избыток крови удаляли фильтровальной бумагой. Оценивали массу влажного тромба.

J. Millet и соавт. [23] сочетали солевые промывки с последующим венозным стазом. Было показано, что промывка индуцирует дискретные эндотелиальные повреждения. При этом максимальной массы тромб достигал через 15 мин воздействия. А в 1996 г. J. Millet и соавт. [24] использовали гомологичную сыворотку в качестве тромбогенного агента в экспериментах на крысах.

K. Ungersböck и соавт. [25] моделировали тромбоз верхнего сагиттального синуса у крыс путем медленной инъекции суспензии каолин-кефалин после передней и задней перевязки сагиттального синуса. Местный мозговой кровоток измеряли при помощи лазерной допплеровской флоуметрии. Исследования показали, что венозный синус-тромбоз развивается постепенно, при этом основные паренхиматозные повреждения головного мозга проявляются только тогда, когда тромб распространяется до кортикальных вен.

Была разработана модель обратимого тромбоза верхнего сагиттального синуса у крыс. Тромбоз вызывали местным применением хлорида железа. Окклюзия была подтверждена магнитно-резонансной ангиографией. В отсутствие лечения развивался диффузный отек мозга без инфарктов и кровотечений [26]. Подобную методику для получения тромбоза верхнего сагиттального синуса у мышей (с применением FeCl3 и фотоактивацией флюоресцеина) использовали в своих экспериментах M. Nagai и соавт. [27].

Также для моделирования сосудистых тромбозов применяют различные травматические модели. В частности, P. Gorman и соавт. [28] моделировали тромбозы кожных сосудов у крыс путем создания ожогового «гребня» с поражением на всю толщину на спине при помощи латунного бруска.

В последнее время для индукции венозного тромбоза в эксперименте часто применяется лазерное воздействие. В процессе использования теплового лазера металлический наконечник лазерного катетера («горячий наконечник») вводили трансюгулярно в дистальный отдел нижней полой вены. Повреждение осуществляли лазерными импульсами разной интенсивности (4-7 Вт). Однако на основании результатов работы был сделан вывод о том, что диапазон мощности термического лазерного воздействия, вызывающий тромбоз или же тепловую перфорацию сосуда, слишком узок, чтобы обеспечить безопасное клиническое применение этого метода [29].

Для получения тромбоза в мелких брыжеечных сосудах (15-25 мкм), в том числе венулах, с целью изучения антитромботических препаратов и реакции тромбоцитов, использовали аргоновый лазер. Лазерный луч индуцировал травму сосудистой стенки, связанную с повреждением эндотелиальных клеток. Тромб формировался в течение нескольких секунд после лазерной травмы и быстро рос. Агрегаты могли быть вымыты током крови, но тромб формировался вновь в течение минуты. Было сделано заключение об особой роли тромбоцитов в венозном тромбозе, индуцированном лазерным лучом [30]. Данная модель была применена для оценки антикоагулянтного эффекта ацетилсалициловой кислоты в сверхмалых дозах [31-33].

F. Doutremepuich и соавт. [34] изучали влияние базового уровня фибриногена в плазме на риск тромбоэмболических осложнений в патогенезе послеоперационного или посттравматического тромбоза. Целью эксперимента являлась оценка последствий воздействия различных доз фибриногена на образование тромбов у крыс. Для формирования тромба повреждали эндотелиальные клетки лазером и вводили фибриноген через вены пениса в различных дозах (50, 100 и 200 мг/кг). Результат оценивали через 120 мин после инъекции. Показано, что воздействие фибриногена увеличивает количество эмболий и продолжительность эмболизации. Таким образом, существует положительная корреляция между повышением концентрации фибриногена в плазме и высоким риском тромбоэмболических осложнений.

Y. Saito и соавт. [35] использовали экспериментальную модель венозной окклюзии при фотодинамическом тромбозе у крыс. После анестезии крысы получали внутрибрюшинно 0,2 мл 10% натрия флюоресцеина за 15 мин до лазерной обработки. Воздействие осуществляли сине-зеленым аргоновым лазером в течение 1 с при следующих параметрах: 50 мкм и 50-100 мВт. Выбранные участки вен рядом со зрительным нервом были фотокоагулированы через линзу в 78 диоптрий. Через 10-30 мин после обработки в секторах сетчатки, связанных с окклюзией вен, развился отек. В течение 12 ч отек перешел в буллезную отслойку сетчатки с кровоизлияниями. Отек сетчатки продолжался 3-10 дней.

Также для формирования тромбоза проводили фотокоагуляцию аргоновым лазером основных вен сетчатки, прилегающих к зрительному нерву, с предварительным введением бенгальского розового (40 мг/кг) в хвостовую вену [36]. Для индукции микровенозного тромбоза сетчатки крыс (фотодинамический тромбоз) использовали фотосенсибилизатор, одновременно с этим была сделана флюоресцентная ангиография [37].

Венозный тромбоз может привести к осложнениям, требующим длительного лечения. Быстрая реканализация тромба снижает риск развития посттромботической болезни. Ныне применяемая антикоагулянтная терапия предотвращает распространение тромбоза, но не удаляет существующие тромбы, которые подвергаются медленному естественному растворению. Тромболизис имеет значимый риск тяжелых кровотечений. Поэтому в клинической практике специалистам не хватает специфического лечения для пациентов с венозными тромбозами, имеющих высокий риск серьезных кровотечений (геморрагический инсульт, желудочно-кишечные язвы). Процесс организации тромба напоминает заживление ран, являясь воспалительным процессом, который зависит от хемокинов и лейкоцитов [12, 38-40].

Фракции моноцитарных клеток периферической крови и красного костного мозга стимулируют ангиогенез. Доказано, что костномозговые клетки-предшественники (плюрипотентные и конкретные линии стволовых клеток) участвуют в естественном разрешении тромбоза, но их точный фенотип и роль в этом процессе пока не ясны [41]. Реваскуляризация тромба, быстрая реканализация вены и восстановление кровообращения в ишемизированных в результате тромбоза тканях были достигнуты в экспериментальных моделях с проангиогенными агентами [42-46].

В экспериментах на крысах изучали изменения количества и функционального состояния костномозговых эндотелиальных клеток-предшественников после стимуляции костного мозга, а также возможные механизмы улучшения течения ишемической болезни конечностей после стимуляции костного мозга посредством аутологичной имплантации костномозговых стволовых клеток. В экспериментальной группе костный мозг у каждой крысы был стимулирован инъекцией рекомбинантного человеческого гранулоцитарного макрофагального колониестимулирующего фактора. Мононуклеарные клетки были собраны из костного мозга и культивированы в течение 7 дней в EBM-2 среде. Затем полученный материал был имплантирован животным в ишемизированные ткани через 3 дня после моделирования односторонней ишемии задних конечностей. Через 3 нед после имплантации было показано значительное увеличение количества сосудистых коллатералей в зоне ишемии в сравнении с контролем. Были сделаны выводы о том, что стимуляция костного мозга увеличивает число эндотелиальных клеток-предшественников и улучшает их функцию, что может улучшать течение ишемической болезни конечностей при стимуляции костного мозга [47].

Y. Gu и соавт. [48] изучали среднесрочные результаты аутологичной трансплантации костномозговых мононуклеарных клеток при лечении ишемии нижних конечностей у людей. У пациентов в общей сложности было забрано 400 мл костного мозга из верхнего заднего гребня подвздошной кости. Затем были выделены мононуклеары. Количество трансплантируемых мононуклеарных клеток костного мозга составляло (0,60-1,80)·109 (в среднем 1,05·109). В зависимости от клинического эффекта пациенты получали от 1 до 4 трансплантаций. За всеми пациентами наблюдали в течение 8-56 мес (в среднем 21,5 мес). Были получены положительные среднесрочные результаты трансплантаций аутологичных мононуклеарных клеток костного мозга.

B. Modarai и соавт. [49] обнаружили, что многие костномозговые производные, Tie2-экспрессирующие клетки, попавшие в тромбы во время организации, несут фенотип макрофагов и могут представлять собой восстанавливающие стволовые клетки, которые управляют процессами реканализации тромба. Рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор может мобилизовать костномозговые клетки моноцитарного ряда в периферическую кровь, что способствует разрешению венозных тромбозов и реканализации сосуда [45].

Эндотелиальные клетки-предшественники также участвуют в разрешении венозных тромбозов. Культура эндотелиальных клеток-предшественников была получена из мононуклеарных клеток человеческой периферической крови. Эти клетки вводили внутривенно от 2 до 4 дней после индукции инфраренального тромбоза нижней полой вены, что сопровождалось существенным увеличением кровотока внутри тромба. Реканализация нижней полой вены и организация тромба были оценены методом лазерной допплерометрии и иммуногистохимическим выявлением новообразованных сосудов в тромбе [46].

Ранее X. Li и соавт. [44] в аналогичном эксперименте изучали влияние эндотелиальных клеток-предшественников, выделенных из костного мозга молодых крыс, культивированных, а затем пересаженных в экспериментально индуцированный тромб нижней полой вены через бедренную вену. Было показано существенное повышение значений уровня фактора роста эндотелия сосудов, ангиопоэтина-1, моноцитарного хемотаксического белка-1, мРНК, которые измеряли в режиме реального времени количественной полимеразной цепной реакцией и методом вестерн-блотинга иммуноблотинга тромбов через 28 дней после трансплантации.

При изучении терапевтического действия трансплантации стволовых клеток с генной трансфекцией на хронические венозные тромбы эндотелиальные клетки-предшественники выделяли из костного мозга крыс с использованием фиколла. После их культивирования в EBM-2MV среде производили трансфицирование рекомбинантным аденовирусным вектором (Аd), несущим фактор роста эндотелия сосудов 165 (VEGF165). Затем клетки были помечены 1,1’-диоктадецил-3, 3,3’,3’-тетраметилиндокарбоцианином. Было показано, что после трансфекции предшественники эндотелиоцитов синтезируют белок VEGF. А следовательно, трансфицированные эндотелиальные прогениторные клетки могут вызывать ускоренную организацию и реканализацию венозных тромбов [19].

Для восстановления поврежденного эндотелия и предотвращения отсроченного тромбоза артериального стента был предложен новый метод адресной доставки стволовых клеток с использованием ультразвука. Исследования проводили in vitro и in vivo на кроликах. Использовали мезенхимальные стволовые клетки с электростатическим покрытием из катионоактивных газонаполненных липидных микропузырьков, клетки вводились внутриаортально. После применения ультразвука (1,7 МГц) была показана максимальная адгезия стволовых клеток в месте повреждения. Стволовые клетки сохранялись в просвете стента и через 24 ч после воздействия [50].

Таким образом, в доступной литературе содержится описание множества экспериментальных моделей венозного тромбоза. Однако самым простым, самым воспроизводимым и наименее травматичным является метод S. Wessler и соавт. (1959): сочетание венозного застоя (например, лигирование вены) и гиперкоагуляции, за счет введения активированного фактора свертывания (например, тромбина).

Также в литературе приводятся косвенные данные о возможности применения стволовых клеток для реканализации тромба или ускоренного роста коллатералей в ишемизированных тканях, но отсутствуют результаты исследований, четко доказывающие рост сосудов в тканевом регионе тромбоза после введения мультипотентных стволовых клеток.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования - И.М., И.К., А.Ш.

Сбор и обработка материала - И.К., С.М., К.С.

Написание текста - И.М., И.К.

Редактирование - И.М., А.Ш., В.М., Я.Н.