Введение

Изучение состава кишечной микробиоты (КМ), ее метаболитов и их влияния на системы организма человека, а также разработка методов целенаправленного воздействия на КМ с терапевтической или профилактической целью стали предметом многочисленных исследований последних лет. Ключевую роль в этой области играют биобанки КМ, разрабатывающие и использующие методы консервирования и длительного хранения нативных образцов. Биобанкирование дает возможность получить своего рода «срез» состояния КМ в конкретный момент времени, а последующий доступ к сохраненным образцам позволяет проводить масштабные и длительные исследования с участием сотен и тысяч людей.

Биобанки КМ могут функционировать в различных форматах и масштабах. Одни являются вспомогательными подразделениями при конкретных клиниках или научно-исследовательских центрах, предоставляющими локальный биоматериал для лечения и научных проектов. Другие действуют как самостоятельные организации, которые специализируются на сборе и хранении образцов, затем распространяя их по запросу исследователям и медицинским учреждениям по всему миру. На сегодняшний день существует целый ряд крупных биобанков КМ. Среди них — AdvancingBio и OpenBiome (США), BiomeBank (Австралия), The English Stool Bank (Великобритания), The Netherlands Donor Faeces Bank (Нидерланды), Metagenopolis (Франция), коллекции при Helmholtz Zentrum München (HMGU) (Германия) и Asia Microbiota Bank (Китай) [1]. Биобанки обеспечивают надлежащее хранение замороженных образцов фекалий доноров и пациентов, сохраняя исходный состав микробного сообщества. В дальнейшем эти образцы могут использоваться для решения широкого спектра задач — от фундаментальных исследований до разработки новых методов лечения заболеваний, связанных с изменением состава и функциональной активности КМ. Хранение образцов по единым стандартам позволяет сравнивать данные, полученные в разных исследованиях, повышает качество и достоверность результатов. Банки КМ выступают трансляционным «мостом» между фундаментальной наукой и клинической практикой, ускоряя внедрение перспективных методов терапии.

В последние годы биобанкирование КМ дополняется глобальными инициативами. Одной из таких инициатив стала созданная в 2016 г. программа Global Microbiome Conservancy¹, в рамках которой проводятся систематический сбор, идентификация и культивирование микробных сообществ со всего мира. Особое внимание уделяется неиндустриализированным, традиционным популяциям и уникальным экологическим нишам, что обеспечивает долгосрочное сохранение редких микробных штаммов. В настоящее время собранная коллекция охватывает широкий спектр таксонов бактерий разных типов, в том числе из некоторых групп, которые ранее считались некультивируемыми. Благодаря программе проведено более 1000 метагеномных исследований с идентификацией более 10 000 видов бактерий. Изначально подавляющее большинство исследований КМ концентрировалось на популяциях США и Западной Европы, при этом данных о микробиоте жителей более чем 120 стран практически не было. Благодаря деятельности Global Microbiome Conservancy удалось существенно расширить географию и репрезентативность коллекции образцов. На сегодняшний день она включает материалы от 1200 участников из свыше 40 малоизученных регионов, в том числе Камеруна, Уганды, Танзании, а также стран Азии, Океании и Латинской Америки. В этих регионах традиционный образ жизни, особенности рациона и ограниченное применение антибиотиков способствуют сохранению уникальных микробных экосистем. Новые данные о КМ таких популяций представляют особую ценность для понимания эволюции микробиома, его роли в развитии иммунитета и метаболизма, а также для разработки универсальных стратегий пробиотического и терапевтического воздействия с учетом глобального многообразия человеческой микробиоты.

Другая крупная инициатива — Microbiota Vault² — создание долговременного «хранилища» микробного разнообразия человечества, биологического «резервного хранилища», предназначенного для предотвращения утраты уникальных штаммов микробиоты в условиях изменения образа жизни, питания, глобализации и широкого применения антибиотиков. Тем самым обеспечивается долгосрочное сохранение микробного разнообразия для будущих поколений исследователей и клиницистов.

В дополнение к этим глобальным инициативам, направленным на длительное сохранение и исследование микробного разнообразия, в Европе создан The European Microbiome Centres Consortium (EMCC)³ — консорциум научно-исследовательских и клинических центров, специализирующихся на изучении микробиома человека. Организация сформирована в рамках проекта Human Microbiome Action и призвана способствовать развитию инновационных трансляционных исследований, потенциально изменяющих подход к профилактическому питанию, здравоохранению и клинической практике, а также оказывать влияние на нормативно-правовое регулирование применения микробиомных технологий.

В разных странах создают локальные инфраструктуры для биобанкирования КМ. В Израиле, например, при некоторых медицинских центрах созданы условия для заготовки и длительного хранения донорских образцов фекальной микробиоты. Подобные подходы способствуют развитию персонализированных терапевтических методов коррекции КМ, таких как трансплантации фекальной микробиоты (ТФМ), и позволяют проводить исследования, ориентированные на специфические особенности местного населения. В странах Восточной Азии — Японии, Южной Корее и Сингапуре — также формируются биобанки КМ на базе крупных научно-исследовательских центров и институтов, таких как RIKEN BioResource Center⁴ в Японии. Кроме крупных национальных и международных центров, многие университеты и клиники по всему миру формируют собственные коллекции образцов. К примеру, такие хранилища КМ действуют при Cleveland Clinic, Mayo Clinic, а также в рамках проектов Human Microbiome Project, в частности при Университете Калифорнии в Сан-Диего.

С учетом многогранного этнокультурного состава Российской Федерации, включающего более 190 национальностей, представляется крайне важным сформировать национальную коллекцию образцов КМ и детально изучить ее состав и метаболическую активность в разных этнических группах с учетом географических и социально-экономических особенностей. В перспективе это создаст научную основу для разработки персонализированных стратегий профилактики и терапии заболеваний, а также позволит сформулировать более точные рекомендации в области питания и здравоохранения, отражающие богатое культурно-биологическое многообразие населения страны.

Одним из приоритетных направлений исследования КМ является выявление связей между ее составом и различными патологическими состояниями организма. Развитие этого направления связано именно с биобанками КМ, так как сбор и хранение биоматериала сопровождаются созданием максимально широкой базы клинических данных, что обеспечивает возможность всесторонней оценки функционального и патогенетического вклада КМ в состояние здоровья.

В арсенале современных терапевтических подходов к коррекции КМ центральное место занимает применение пробиотиков, аутопробиотиков и ТФМ. Разработка, стандартизация и внедрение указанных методов невозможны без функционирования исследовательских и клинических биобанков КМ, организованных в соответствии с актуальными рекомендациями и нормативами, регламентирующими процедуры сбора, обработки и хранения биоматериала вплоть до его практического использования⁵, ⁶, ⁷.

Цель обзора — выполнить анализ актуальных данных о формировании исследовательских и терапевтических биобанков КМ человека, а также о разработке рекомендаций по методологии ее биобанкирования.

Информация, представленная в обзоре, позволит ознакомиться с современными данными о биобанкировании КМ и ее подготовке к применению в исследовательских и терапевтических целях. Обзор предназначен для широкого круга специалистов, включая исследователей, экспертов в области биобанкирования и врачей-клиницистов.

Материал и методы

Проведен поиск публикаций на русском и английском языках в базах данных eLibrary и PubMed. Рассматривались источники, опубликованные не ранее 2019 г., соответствующие тематике статьи. Поиск выполнен по ключевым словам, представленным в данной статье. В результате анализа отобрано 39 полнотекстовых статей, которые легли в основу данного обзора.

Основная часть

Биобанк кишечной микробиоты — перспективный инструмент персонализированной медицины

Микробиота кишечника — сложная динамическая система, состоящая из бактерий, архей, грибов, вирусов и простейших; она колонизирует желудочно-кишечный тракт и является самой сложной экосистемой, существующей в природе [2]. Состав КМ представлен шестью филотипами, из которых 90% составляют Bacillota (ранее Firmicutes) и Bacteroidota, далее в порядке убывания располагаются Actinobacteriota, Verrucomicrobiota, Alphaproteobacteriota (ранее Proteobacteria) и Methanobacteriota (ранее Euryarchaeota) [3, 4].

Термин «микробиом» охватывает как микробиоту (сообщество микроорганизмов), так и ее функциональные характеристики (дословно «theatre of activity» — «театр деятельности»): метаболиты, сигнальные молекулы, токсины, органические и неорганические субстанции, ключевые структурные компоненты, ДНК, РНК и компоненты окружающей среды [5]. Одним из наиболее спорных вопросов в исследовании микробиома остается определение «здорового» человеческого микробиома. Из-за изменчивости состава КМ в различных пространственно-временных масштабах до сих пор отсутствует единое определение спектра «здоровых» конфигураций микробиома. В рамках этой задачи составлена дорожная карта, направленная на углубление знаний о взаимосвязи между микробиомом и здоровьем. Она включает эпидемиологические подходы, ориентированные на изучение уникальных экологических характеристик различных сообществ, что позволяет оценить их влияние на здоровье человека [6].

За последние годы в области биобанкирования КМ произошел сдвиг парадигмы от хранения изолятов отдельных бактерий в сторону криоконсервирования сложных консорциумов микроорганизмов [3, 4]. Одним из возможных объяснений этой тенденции может быть важность взаимодействий между различными членами микробиоты, таких как явление «кворумного чувства» (quorum sensing), которое можно изучать при условии, что будет обеспечено сохранение нативного состава КМ донора [7].

На сегодняшний день имеются убедительные данные, что изменение в составе КМ, или дисбиоз, участвует в патогенезе ряда заболеваний, включая неалкогольную жировую болезнь печени, болезнь Крона и язвенный колит [2, 3]. Болезнь Крона и язвенный колит являются сложными иммуноопосредованными заболеваниями, которые характеризуются значительной гетерогенностью проявлений и клинического течения. Доказано, что КМ играет важную роль в патогенезе этих заболеваний. Биомаркеры, основанные на анализе состава КМ, рассматриваются как перспективные инструменты для стратификации риска, прогнозирования течения заболевания и оценки ответа на лечение. Первые поперечные исследования выявили снижение микробного разнообразия у пациентов с болезнью Крона и язвенным колитом, истощение филумов с противовоспалительным эффектом и увеличение численности потенциально патогенных бактерий при определенных фенотипах заболеваний. Продольные исследования, отслеживающие изменения микробиоты и клинические исходы во времени, показали, что динамика состава КМ тесно коррелирует с активностью заболевания, резистентностью к терапии и может служить предиктором клинических исходов. Для достоверной проверки таких биомаркеров и их успешной интеграции в клиническую практику необходимы многоцентровые исследования, основанные на использовании коллекций биобанков КМ и унифицированных методологических протоколов [8].

Индивидуальные особенности микробиома находят применение в персонализированной профилактике и терапии многих соматических и инфекционных заболеваний. Для этих целей применяются таргетные пробиотики, аутологичная и гетерологичная ТФМ. Кроме того, показано, что коррекция микробиома возможна с использованием аутопробиотиков — собственных полезных представителей микробиоты пациента, которые могут быть выделены, сохранены и многократно использованы в профилактических и терапевтических целях. Для обеспечения этой стратегии требуется создание специализированных биобанков, которые позволят организовать сбор, хранение и последующее использование аутопробиотиков [9, 10].

Отечественные ученые добились значительных успехов в разработке аутопробиотиков. В ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» Минобрнауки России (Санкт-Петербург) разработан комплексный подход, включающий генетический анализ отбираемых бактериальных клонов, видовую идентификацию штаммов, исследование на наличие генов патогенности, устойчивости к антибиотикам, а также биобанкирование отобранных аутопробиотических штаммов для повторного применения. На основе проведенных исследований отечественными специалистами разработаны и описаны медицинские технологии использования аутопробиотиков в комплексной терапии таких заболеваний, как колоректальный рак, спондилоартрит, сахарный диабет и др. [11—16].

Перспективным направлением исследований является изучение пробиотических штаммов для создания универсальных пробиотиков, подходящих для большинства людей, а также разработка пробиотических средств с таргетными свойствами для индивидуального применения. Для развития этого направления признано целесообразным биобанкирование штаммов пробиотических микроорганизмов, что позволит проводить сравнительные исследования их свойств и разрабатывать подходы для дальнейшего применения [17]. Каждый пробиотический препарат должен проходить этапы полногеномного секвенирования и анализа генома с целью изучения патогенного потенциала штамма, а также оценки ключевых пробиотических характеристик, таких как бактериоциногенность, антимикробная и иммуномодулирующая активность, адгезивные свойства и пр. [18]. Кроме того, необходимо исследовать влияние пробиотических штаммов на функции пищеварения [9].

Персонализированное применение пробиотиков и аутопробиотиков, создание искусственной микробиоты и управление микробиомом, который играет ключевую роль в регуляции функций организма, возможны только при наличии хорошо организованных биобанков микробиомов, содержащих разнообразные микроорганизмы.

Одним из важных направлений развития биобанков КМ является хранение биообразцов для ТФМ. На сегодняшний день клинически обоснованным показанием к ТФМ остается рецидивирующая форма инфекции Clostridioides difficile (ИКД) (3 эпизода и более), а также тяжелая или фульминантная ИКД без ответа на антибиотикотерапию. Кроме того, методика ТФМ активно изучается в рамках клинических испытаний, в которых необходимо участие биобанков КМ.

Получены данные об успешном использовании процедуры ТФМ при язвенном колите, болезни Паркинсона и других заболеваниях [19, 20]. Однако лицензирование и применение в лечебной практике ТФМ осложняется, поскольку использование донорских образцов фекалий связано с определенными рисками, включая вероятность передачи условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Для назначения ТФМ требуется длительное и дорогостоящее исследование донорского материала, чтобы минимизировать риск для реципиентов. В этом контексте биобанки, специализирующиеся на хранении КМ, играют ключевую роль, обеспечивая тщательное исследование донорских образцов и их сохранение до применения. Огромным преимуществом по сравнению с гетерологичной ТФМ (использованием проб, взятых от донора) является введение собственной микробиоты в виде заранее банкированных проб фекалий пациента в благоприятный период (до возникновения патологии или в период ремиссии заболевания). Это снижает риск иммунологических осложнений и устраняет необходимость в дополнительном скрининге, поскольку материал уже принадлежит пациенту [21].

За последнее десятилетие создано несколько биобанков КМ при лечебных учреждениях и крупных некоммерческих банков КМ, которые покрывают потребность в донорской КМ для ТФМ. Такие биобанки предназначены для безопасного строго регламентированного сбора, хранения и распределения донорской КМ. Ранее донорами выступали близкие пациента либо члены его семьи, однако затем данный подход был подвергнут критике ввиду необходимости подбора доноров для ТФМ по разработанным критериям, обеспечивающим безопасность пациента. Скрининг потенциальных доноров занимает продолжительное время, и если в процессе обследования у кандидата выявляются противопоказания к донации, то проведение ТФМ должно быть отложено до того момента, пока не будет найден подходящий донор [4]. В данном контексте биобанки замороженной фекальной микробиоты решают сразу две задачи:

1) предоставляют уникальную возможность приглашать потенциальных доноров микробиоты заранее и создавать крупные коллекции донорской КМ, решая проблему ожидания донорской КМ;

2) обеспечивают тщательное исследование образцов КМ перед включением в коллекцию и хранением, что позволяет сделать процедуру ТФМ максимально безопасной для пациента [22].

Ярким примером успешной реализации такого подхода является OpenBiome — независимый некоммерческий биобанк, созданный в США в 2012 г. OpenBiome централизованно поставляет замороженные образцы фекалий врачам по всей стране. Уже к 2017 г. банк обеспечивал около 10 000 доз кала ежегодно, сделав ТФМ стандартом лечения рецидивирующей и рефрактерной ИКД [23]. Возможность замораживать, хранить в биобанках и распределять донорский материал повысила доступность процедуры ТФМ для пациентов с ИКД.

Биобанки фекалий могут принимать участие в научных исследованиях, связанных с процедурой ТФМ. В настоящее время продолжается изучение применения ТФМ при воспалительных заболеваниях кишечника, синдроме раздраженного кишечника и внекишечных заболеваниях. Однако до получения убедительных доказательств эффективности и безопасности ТФМ ее не следует назначать пациентам в рутинной клинической практике. Для заинтересованных пациентов оптимальным вариантом является участие в клинических исследованиях, в рамках которых используется замороженная донорская микробиота. Одновременно накапливаются данные для разработки рекомендаций по применению ТФМ в лечебной практике [1, 3, 24].

В контексте указанных направлений важнейшими задачами банков КМ являются разработка протоколов обработки, консервирования, хранения первичных проб фекалий, оценки качества хранимых образцов биоматериала, а также соблюдение всех принятых стандартов. Эти меры необходимы для гарантии пригодности образцов КМ к использованию в научных и терапевтических целях [25]. Несоблюдение условий обработки и хранения образцов фекалий для ТФМ может привести к необратимым изменениям в составе и функциональной активности КМ человека после трансплантации.

Общие принципы организации биобанков кишечной микробиоты

Организация инфраструктуры микробных биобанков, включая биобанки КМ, требует соблюдения единых технических стандартов и учета особенностей работы с микроорганизмами.

Ключевые параметры биообразцов, влияющие на их качество и, соответственно, на качество результатов исследований микробиома, включают: время, прошедшее между сбором фекалий и замораживанием или обработкой (извлечением ДНК); температуру и длительность транспортировки; температуру хранения; срок хранения биообразца в замороженном состоянии; наличие и количество циклов замораживания—оттаивания; тип емкости для сбора и хранения образцов; используемые консерванты.

Основные принципы организации биобанков КМ включают в себя следующие аспекты:

1. Соблюдение правил безопасности при работе с микроорганизмами (биозащита для сотрудников и биобезопасность для внешней среды);

2. Организация хранения биоматериала. В зависимости от целей дальнейшего использования (исследовательских или терапевтических), а также предполагаемых сроков хранения биоматериала могут использоваться различные системы хранения:

— холодильники с температурой +4 °C и морозильники с температурой –20 °C для хранения лиофилизированных выделенных культур микроорганизмов или временного размещения биоматериалов перед дальнейшей обработкой;

— морозильные камеры с температурой –80 °C используются для хранения биоматериалов, которые могут быть необходимы в течение нескольких лет;

— криохранилища с использованием паров жидкого азота (–140 °C и ниже) применяются для замораживания образцов в средах с криопротекторами, что позволяет максимально сохранить жизнеспособность микроорганизмов и целостность фекальных образцов;

3. Каждому образцу присваивается уникальный идентификационный код, который сопровождается в базе данных подробной информацией о доноре, условиях отбора, способе обработки и предполагаемых целях использования;

4. Планирование помещений и инфраструктуры по принципам организации микробиологических лабораторий в составе клинико-диагностических лабораторий в соответствии с группой патогенности [26];

5. Наличие системы непрерывного мониторинга всех параметров условий хранения, включая электроснабжение, системы автоматического подключения резервного электроснабжения, системы сигнализации, оповещающей в случае отклонений от нормы любого из параметров, системы видеонаблюдения и регламентированного доступа в биобанк;

6. Этические и правовые аспекты. Для соблюдения этических норм требуются подписание и хранение форм информированного добровольного согласия доноров КМ на использование биоматериала в исследовательских и/или терапевтических целях в рамках клинических испытаний и персонализированного лечения;

7. Наличие базы данных с сопутствующей информацией о биообразцах и донорах. Сведения о донорах, используемые в биобанках КМ, охватывают широкий спектр данных, включающих демографическую характеристику (возраст, пол, этническая принадлежность, место рождения и проживания — городская или сельская среда), медицинскую информацию (группа крови, индекс массы тела, наличие хронических заболеваний, аллергии, режим дефекации, прием лекарств, в том числе антибиотиков и пробиотиков) и аспекты образа жизни (режим питания, пищевые привычки, уровень и частота физических нагрузок, вредные привычки, уровень стресса, качество сна и др.) [27];

8. Для обеспечения стандартизации процессов обработки и хранения образцов КМ в каждом биобанке должны быть разработаны и утверждены стандартные операционные процедуры (СОП) для всех этапов процесса сбора, хранения и выдачи биоматериала. Внедрение в практику биобанка КМ системы менеджмента качества обеспечивает качество и безопасное надежное хранение биоматериала, необходимое для исследовательских и терапевтических целей [28, 29].

Особенности организации исследовательских биобанков кишечной микробиоты

В состав КМ входит широкий спектр микроорганизмов, большая часть которых является сложнокультивируемыми и некультивируемыми. Поэтому наиболее популярным современным методом исследования состава КМ является метагеномный анализ, при проведении которого не требуется выполнения посева, и он дает полную информацию о составе КМ. Однако для научных исследований остается важной задачей развитие технологий культивирования, особенно тех микроорганизмов, которые могут быть перспективными пробиотическими штаммами. Методология биобанкирования КМ имеет свои особенности, которые определяются целью дальнейшего использования биоматериала. Принципиальное различие заключается в необходимости сохранения жизнеспособности микроорганизмов или в ее отсутствии. Для метагеномного анализа жизнеспособность сохранять не требуется, так как исследование ориентировано на выделение и анализ генетического материала. Напротив, для бактериологических исследований, разработки пробиотиков и аутопробиотиков или ТФМ сохранение жизнеспособности микроорганизмов является критически важным, что означает необходимость соблюдения строгих условий транспортировки и хранения, включая использование криопротекторов.

Методология сбора, обработки и хранения образцов микробиоты кишечника для метагеномного и метапротеомного анализа

Критерии отбора доноров. В зависимости от цели исследования разрабатывают критерии, по которым выбирают доноров фекалий. Например, для изучения связи особенностей состава КМ с определенным патологическим состоянием формируют контрольную группу и группу с наиболее выраженным фенотипом заболевания.

Сбор и обработка образцов. Для сохранения всего спектра микроорганизмов в образце, собранном в пустой стерильный контейнер, замораживание при температуре от –70 до –80 °C или обработка фекалий (выделение ДНК) должны проводиться в течение 30 мин после получения материала или после транспортировки при температуре +4 °C в течение 4 ч. Если соблюсти эти условия не представляется возможным, для сохранения нативности образцов фекалий их собирают в специальные контейнеры с криопротектором и консервантом. В этом случае образцы можно транспортировать до 24 ч при температуре +4 °C, затем их аликвотируют в маркированные криопробирки объемом 2—5 мл, замораживают при температуре от –70 до –80 °C и хранят до дальнейшего анализа. При создании коллекции биобанка OpenBiome использовали метод сбора, предполагающий получение и обработку свежих образцов фекалий в течение 6 ч с момента получения, их гомогенизацию в буфере, содержащем 12,5% глицерина и 0,9% хлорида натрия по массе (относительное соотношение буфера и кала составляло либо 10:1, либо 2,5:1 объем/масса), и фильтрацию гомогенизированных образцов через 330-микронный фильтр с последующим хранением при температуре –80 °C [30].

Использование криопротекторов в биобанкировании фекалий является универсальным методом как для метагеномного анализа, так и для исследования живых микроорганизмов. Для метагеномного анализа он не является обязательным, так как нет необходимости сохранять жизнеспособность микрофлоры, а важно лишь защитить ДНК от деградации, для чего достаточно соблюдения температурного режима.

Для проведения метагеномного анализа аликвоты фекалий размораживают, выделяют тотальную ДНК и проводят секвенирование с биоинформатическим анализом. В результате получают информацию о количественном и качественном составе КМ. Выделенная из образцов ДНК может быть заморожена и храниться для дальнейших исследований при температуре от –20 до –70 °C в зависимости от методики выделения (универсальной является температура –70 °C).

Важный аспект исследований КМ — «кризис научной воспроизводимости». Так, в течение многих лет было принято проводить и публиковать исследования микробиома на основе секвенирования без надлежащего контроля. Внедрение контроля и стандартов проведения исследований метагенома, а также интерпретации контроля является современной проблемой [31].

Метапротеомный анализ. Метапротеомика позволяет анализировать активность и функции микробного сообщества посредством идентификации белков. Критически важным при этом является сохранение образцов перед анализом, поскольку профили белков подвержены быстрым изменениям в ответ на изменения условий окружающей среды (воздействие воздуха, колебания температуры и т.д.). Например, обработка раствором RNAlater или мгновенное замораживание обеспечивают минимальные изменения в метапротеоме (<0,7% от нативного материала). Консервация в RNAlater при комнатной температуре также признана эффективной [32].

Методология сбора, обработки и хранения образцов микробиоты кишечника для бактериологического анализа, выделения отдельных культур микроорганизмов и трансплантации фекальной микробиоты

Для бактериологических исследований и выделения культур микроорганизмов с целью разработки и производства пробиотиков и аутопробиотиков, а также для проведения ТФМ сохранение жизнеспособности всех микроорганизмов в образцах фекалий является критически важным. Необходимо применение криопротекторов при сборе и хранении образцов фекалий. Так, 10—15% растворы медицинского глицерина или диметилсульфоксида минимизируют повреждение клеток при замораживании. Транспортировка таких образцов должна проводиться при строго контролируемых условиях (низкое содержание кислорода, температура +4 °C) в течение не более 6 ч, а хранение осуществляется при температуре –80 °C или ниже [30].

Замораживание и выживаемость микроорганизмов. Исследования показали, что использование глицеринового буфера в качестве криопротектора эффективно сохраняет аэробные микроорганизмы. Установлено, что при замораживании фекалий аэробные микроорганизмы практически не теряют своей жизнеспособности, что делает данный метод оптимальным для исследований, ориентированных на аэробные культуры [33]. Однако анаэробные бактерии, составляющие значительную часть КМ, демонстрируют меньшую устойчивость к процессу замораживания. Несмотря на использование глицеринового буфера, который снижает образование ледяных кристаллов и минимизирует механическое повреждение клеток, выживаемость анаэробов заметно снижается. Тем не менее эти изменения остаются в пределах межиндивидуальных вариаций и не приводят к существенному искажению общей картины микробиоты в образцах. Это особенно важно для исследований, в которых требуются количественные и качественные данные о составе анаэробных микробов.

Методы оценки стабильности микробиоты при хранении и транспортировке. Современные методы, такие как RapidAIM и количественная метапротеомика, позволяют оценивать влияние замораживания и отсроченной обработки на жизнеспособность и функциональные свойства микробиоты [34]. В исследованиях показано, что образцы микробиоты, стабилизированные в дезоксигенированном 10% растворе глицерина и хранящиеся при –80 °C, сохраняют свою функциональную активность и реакцию на пребиотики, такие как фруктоолигосахариды, в течение 12 мес. Кроме того, микробиота, транспортируемая в глицериновом буфере на льду, остается стабильной в течение 48 ч, что делает возможным ее безопасную доставку в лабораторию для дальнейшего биобанкирования [33]. Эти данные подтверждают, что использование стабилизирующих растворов и низкотемпературных методов хранения обеспечивает сохранение функциональных свойств микробиоты, что крайне важно для исследований, разработки пробиотиков и клинического применения.

Влияние контакта с воздухом и циклов замораживания—оттаивания на микробиоту. Контакт фекальных образцов с окружающим воздухом оказывает значительное негативное влияние на жизнеспособность микроорганизмов, что связано с их чувствительностью к окислительным процессам. В частности, численность ключевых комменсальных бактерий, таких как Faecalibacterium prausnitzii, может снижаться более чем в 10 раз. Это объясняется тем, что анаэробные микроорганизмы, составляющие значительную часть КМ, особенно уязвимы к воздействию кислорода. Для минимизации подобных потерь рекомендуется использовать анаэробные условия при сборе и транспортировке образцов, включая применение дезоксигенированных буферов и герметичных контейнеров. Циклы замораживания и оттаивания также оказывают влияние на жизнеспособность микрофлоры. Исследования показали, что повторные циклы могут уменьшить количество жизнеспособных микроорганизмов примерно на 20%. Этот эффект связан с повреждением клеточных мембран и структур микроорганизмов в процессе кристаллизации и оттаивания воды. Однако, несмотря на снижение жизнеспособности, общий состав микробиоты остается относительно стабильным, что позволяет сохранять ее функциональные свойства для большинства видов исследований [35].

Особенности организации терапевтических биобанков кишечной микробиоты

Терапевтические биобанки КМ создаются для обработки, хранения и обеспечения доступности препаратов, включающих пробиотики, аутопробиотики и КМ в составе исходных фекалий здоровых доноров, используемых в ТФМ. Все процессы в биобанках организуются в соответствии с требованиями микробиологических лабораторий, включая биозащиту и биобезопасность, что гарантирует безопасность препаратов живых микроорганизмов при их клиническом применении. Препараты на основе КМ хранятся в строго контролируемых условиях: пробиотические и аутопробиотические штаммы сохраняются в лиофилизированном виде при температуре –20 °C либо в 10% растворе глицерина при –80 °C, что обеспечивает долгосрочную сохранность их жизнеспособности [36].

Методика ТФМ остается относительно новой, и разнообразие протоколов обработки и хранения фекалий объясняется нехваткой унифицированных нормативных документов. Однако публикация ключевых рекомендаций, таких как руководство Британской ассоциации гастроэнтерологов (2018) и Международный консенсус по созданию банков фекалий (2019), стала важным шагом к стандартизации [37, 38]. Эти документы регламентируют показания к проведению ТФМ, способы сбора, обработки, хранения и транспортировки биоматериалов, а также устанавливают организационные и технические требования к работе биобанков.

Для достижения высокой эффективности процедуры (>70%) важно использовать замороженные образцы, обработанные в течение 6 ч после сбора, растворенные в 10% глицерине, замороженные при –80 °C и хранящиеся не более 6 мес. Замораживание с использованием криопротекторов, таких как глицериновый буфер, минимизирует изменения в составе микробиоты, сохраняя ключевые бактерии, включая анаэробы. Исследования подтвердили, что замороженные образцы демонстрируют такую же клиническую эффективность, как и свежие, что делает их применение более практичным и экономически выгодным решением, особенно для централизованных биобанков, обеспечивающих широкий доступ к стандартным препаратам для ТФМ [33, 38]. Такой подход не только оптимизирует логистику и позволяет проводить необходимый скрининг, повышая безопасность и доступность процедуры, но и способствует созданию в целом надежной инфраструктуры для внедрения ТФМ в клиническую практику.

Заключение

Биобанкирование кишечной микробиоты является важным инструментом для научных исследований и клинической практики. Основная цель методологии биобанкирования кишечной микробиоты заключается в минимизации отклонений в целостности нативных образцов, что возможно при строгом соблюдении стандартов сбора, транспортировки, обработки и хранения биообразцов.

Анализ результатов исследований показывает, что допустимый интервал времени между сбором и замораживанием биоматериала варьируется в разных работах от 30 мин до 24 ч в зависимости от целей исследования, температуры транспортировки, используемых контейнеров и консервантов. Оптимальным (универсальным) протоколом для анализа микробиома является сбор фекалий в специализированные контейнеры с транспортировкой при температуре +4 °C в течение 6 ч, применение криопротектора 10% глицерина с последующим хранением при температуре –80 °C. Хранение выделенных культур микроорганизмов для применения в качестве пробиотиков и аутопробиотиков рекомендуется в лиофилизированном виде при температуре +4 и –20 °C. Внедрение таких стандартов и технологий обеспечивает надежную основу для дальнейших исследований кишечной микробиоты и разработки инновационных терапевтических подходов.

Наличие централизованных биобанков и унифицированных протоколов сбора, пробоподготовки и хранения кишечной микробиоты и ассоциированных клинических данных способствует ускорению трансляции научных достижений в медицину, включая создание персонализированных методов лечения.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Покровская М.С., Борисова А.Л., Яфарова А.А., Шептулина А.Ф., Драпкина О.М.

Сбор и обработка материала — Покровская М.С., Борисова А.Л., Яфарова А.А., Шептулина А.Ф.

Статистический анализ данных — Покровская М.С., Борисова А.Л., Яфарова А.А., Шептулина А.Ф.

Написание текста — Покровская М.С., Борисова А.Л., Яфарова А.А., Шептулина А.Ф., Драпкина О.М.

Редактирование — Шептулина А.Ф., Драпкина О.М.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors contribution:

Study design and concept — Pokrovskaya M.S., Borisova A.L., Yafarova A.A., Sheptulina A.F., Drapkina O.M.

Data collection and processing — Pokrovskaya M.S., Borisova A.L., Yafarova A.A., Sheptulina A.F.

Statistical analysis — Pokrovskaya M.S., Borisova A.L., Yafarova A.A., Sheptulina A.F.

Text writing — Pokrovskaya M.S., Borisova A.L., Yafarova A.A., Sheptulina A.F., Drapkina O.M.

Editing — Sheptulina A.F., Drapkina O.M.

¹ Global Microbiome Conservancy. Accessed September 29, 2025. https://microbiomeconservancy.org/

²The Microbiota Vault. Accessed September 29, 2025. https://www.microbiotavault.org/

³ The European Microbiome Centres Consortium (EMCC). Accessed September 29, 2025. https://humanmicrobiomeaction.eu/european-microbiome-centres-consortium/

⁴The Microbiota Vault. Accessed September 29, 2025. https://www.microbiotavault.org/

⁵The European Microbiome Centres Consortium (EMCC). Accessed September 29, 2025. https://humanmicrobiomeaction.eu/european-microbiome-centres-consortium/

⁶ISO 24088-1:2022 Biotechnology — Biobanking of microorganisms — Part 1: Bacteria and archaea.

⁷ ISO 21710:2020 Biotechnology — Specification on data management and publication in microbial resource centers.