Дисферлинопатия — это орфанное (1—9:1 000 000, Orphanet, 2024) аутосомно-рецессивное заболевание из группы мышечных дистрофий, характеризующееся дефицитом белка дисферлина вследствие мутаций в гене DYSF (OMIM 603009, 2p13, NM_003494.4) [1]. Заболевание представлено несколькими клиническими формами: поясно-конечностной мышечной дистрофией типа R2 (limb-girdle muscular dystrophy type R2, LGMD R2; OMIM 253601), дистальной миопатией Миоши (Miyoshi muscular dystrophy-1, MMD-1; OMIM 254130), дистальной миопатией с начальным вовлечением передних большеберцовых мышц (distal myopathy with anterior tibial onset; DMAT, OMIM 606768), а также врожденной дисферлинопатией [2, 3].

Помимо скелетных мышечных волокон (МВ) и кардиомиоцитов, ген DYSF экспрессируется в клетках Пуркинье мозжечка, альвеолоцитах легких, эпителии канальцев почек и эндометрия [4]. Мутации в гене DYSF обусловливают отсутствие или афункциональность белка дисферлина и, как следствие, нарушения репарации значительных дефектов мембран МВ, что приводит к их массированной гибели из-за устойчивого накопления цитозольного Ca²⁺ с последующей активацией протеолитических ферментов. Наиболее частыми ультраструктурными изменениями, описанными в научной литературе, являются уплотнение и фрагментация базальной мембраны, истончение и лизис миофибрилл, а также разрывы сарколеммы и наличие субсарколеммальных везикул, часто располагающихся в областях разрывов. Данные об изменении ультраструктуры других клеточных элементов скелетных мышц (фибробластов, миосателлитоцитов, телоцитов, эндотелиоцитов и др.) отсутствуют.

Сложность диагностики дисферлинопатии обусловливает необходимость поиска дополнительных диагностических критериев, позволяющих верифицировать заболевание в случаях, когда молекулярно-генетическое и иммуногистохимическое исследования не дают однозначного ответа. В данном контексте важно установить, обладают ли ультраструктурные изменения скелетных мышц достаточной специфичностью для дифференциальной диагностики дисферлинопатии. Для поиска критериев, применимых в неоднозначных случаях, важно проанализировать ультраструктурные изменения в классических случаях дисферлинопатии, подтвержденных на генетическом и иммуногистохимическом уровнях.

Цель исследования — выявить ультраструктурные патоморфологические особенности скелетных мышц у 6 пациентов с дисферлинопатией.

Материал и методы

Выполняли инцизионную биопсию m. tibialis anterior и m. vastus lateralis 6 пациентам с диагнозом дисферлинопатии, верифицированным методом NGS и подтвержденным референсным методом секвенирования по Сэнгеру. У 1 пациента с установленным сложным генотипом были выявлены как мутация в гене DYSF, так и миссенс-мутация c.178G>T (p.Tyr140His) в гене SIL1 (Chr5:138456790), ассоциированная с синдромом Маринеску–Шегрена (табл. 1).

Таблица 1. Выявленные мутации в гене DYSF

Примечание. ПКМД — поясно-конечностная мышечная дистрофия.

Методология и этические аспекты исследования были определены в протоколе обсервационного исследования, зарегистрированного в ClinicalTrials.gov (NCT04824040), и утверждены локальным Этическим комитетом Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова. Часть мышц фиксировали в 10% забуференном формалине, заливали в парафин по стандартной методике [5]. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином и иммуногистохимически с антителами к дисферлину (ab124684, «Abcam», Великобритания). Для фотодокументации использовали микроскоп Leica DM1000 («Leica Microsystems», Германия). Для контроля брали фрагмент m. vastus lateralis, полученный во время аутопсии трупа мужчины 38 лет, не страдавшего при жизни аутоиммунными, ревматическими и нервно-мышечными заболеваниями. Другую часть мышц фиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде на 0,1М фосфатном буфере с последующей заливкой в аралдитовую смолу для изготовления полутонких и ультратонких срезов. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим, ультратонкие срезы (50—100 нм) контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу с дальнейшей трансмиссионной электронной микроскопией на микроскопе JEM-100CX («JEOL», Япония).

Результаты и обсуждение

При патогистологическом исследовании парафиновых срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, у всех пациентов выявлены полиморфизм, заключающийся в вариабельности размеров поперечных срезов МВ, распространенная атрофия и некроз МВ, большое количество МВ с интернализированными ядрами. Обнаружены диффузный эндомизиальный и перимизиальный фиброз и липоматоз (рис. 1, а); умеренная, преимущественно эндомизиальная лимфоцитарно-макрофагальная инфильтрация (рис. 1, б).

Рис. 1. Патогистологические признаки повреждения скелетных мышц (m. vastus lateralis).

а — полиморфные и разноразмерные МВ, перимизиальный липоматоз; б — эндомизиальный лимфоцитарно-макрофагальный инфильтрат. Окрашивание гематоксилином и эозином, ×100.

Результаты иммуногистохимического исследования продемонстрировали, что во всех случаях мутации в гене DYSF приводили к отсутствию белка дисферлина в скелетной мышечной ткани, что подтверждает их патогенный характер. Таким образом, диагноз дисферлинопатии, установленный молекулярно-генетическими методами исследования, был подтвержден иммуногистохимически (рис. 2).

Рис. 2. Иммуногистохимическое окрашивание с антителами к дисферлину.

а — отсутствие дисферлина в саркоплазматической мембране и цитоплазме МВ; б — субсарколеммное окрашивание дисферлина в образце здоровой мышечной ткани. Иммуногистохимическая реакция, ×200.

При электронно-микроскопическом исследовании в образцах всех пациентов обнаружены выраженные ультраструктурные изменения МВ и компонентов стромы скелетных мышц.

Выявлены уплотнение и фрагментация базальной мембраны МВ, складчатость и фокальные разрывы сарколеммы (рис. 3, а). Вблизи сарколеммы МВ обнаружены некротизированные миосателлитоциты (рис. 3, б).

Рис. 3. Ультраструктурные изменения МВ.

а — уплотнение базальной мембраны МВ, очаговые разрывы сарколеммы (стрелки); б — некротизированный миосателлитоцит; в — скопление мелких полиморфных митохондрий с электронно-плотным матриксом (стрелки); г — скопления везикул по периферии МВ в участках разрывов сарколеммы (стрелки); д — участок деструкции миофибрилл со скоплением крупных, вакуолизированных митохондрий; е — дезорганизация и мелкоочаговый лизис миофибрилл; ж — зигзагообразный, размытый вид Z-линии (стрелки); з — очаговое отсутствие Z-линий, T-трубочек и T-системы; и — деструктивные изменения ядра МВ. Трансмиссионная электронная микроскопия; б, в, ж ×12 000; а, г, е, з ×14 000; д, и ×17 000.

Субсарколеммально локализованы скопления мелких полиморфных митохондрий шириной 150—310 нм с электронно-плотным матриксом и плохо различимыми кристами (рис. 3, в). Преимущественно в местах нарушения целостности сарколеммы сконцентрированы множественные везикулы размером 20—50 нм с гомогенным содержимым, окруженные однослойной мембраной (рис. 3, г).

Отек саркоплазмы с мелкогранулярным содержимым обнаружен в основном в перинуклеарной зоне. Определены участки деструкции миофибрилл с большим количеством отечных, просветленных митохондрий с разрушенными кристами и множественными разрывами внутренней мембраны, сохранившиеся фрагменты которой агрегированы в разных участках матрикса (рис. 3, д). Выявлены нарушения структуры саркомеров: дезорганизация и истончение миофибрилл с мелкоочаговым лизисом и фрагментацией (рис. 3, е); дезорганизация миофиламентов, уменьшение выраженности Z-линий (реже M-линий) до полной утраты; зигзагообразный, размытый вид Z-линии (рис. 3, ж); исчезновение T-трубочек и саркотубулярных цистерн (рис. 3, з). В расширенных канальцах саркоплазматического ретикулума (СПР) определяется осмиофильное содержимое. Отмечены выраженные изменения ядра с множественными инвагинациями и частичным отсутствием нуклеолеммы, просветленной нуклеоплазмой с мелкоглыбчатым содержимым, аномальной агрегацией хроматина (рис. 3, и).

В строме обнаружены функционально активные фибробласты с резко расширенными канальцами гранулярной эндоплазматической сети в окружении многочисленных новообразованных коллагеновых волокон (рис. 4, а).

Рис. 4. Ультраструктурные изменения компонентов стромы и нервно-мышечных соединений.

а — коллагенпродуцирующий фибробласт с характерной ультраструктурной организацией в окружении новообразованных коллагеновых волокон (*); б — неравномерное изменение ширины синаптической щели и глубины складок постсинаптической мембраны (стрелки), электронно-плотный материал в просвете синапса; в — некротизированный телоцит (стрелка); г — пикноз ядра телоцита. Трансмиссионная электронная микроскопия; ×8900.

Ультраструктурные изменения нервно-мышечных соединений включают неравномерное изменение ширины синаптической щели и глубины складок постсинаптической мембраны, а также фокальную конденсацию заполняющего их вещества (рис. 4, б).

Выявленные вблизи сарколеммы телоциты находятся в состоянии некроза, при этом плазматическая мембрана не имеет четких контуров, в мелкоглыбчатой цитоплазме отсутствуют органеллы, в некоторых телоцитах отмечен кариопикноз (рис. 4, в, г).

В силу технических ограничений трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) не является рутинным методом диагностики дисферлинопатии и других наследственных миопатий. Выявленные ультраструктурные изменения поперечнополосатой скелетной мышечной ткани при дисферлинопатии в сопоставлении с ранее описанными в литературе представлены в табл. 2.

Таблица 2. Характерные ультраструктурные изменения скелетных мышц при дисферлинопатии

Примечание. Н/д — нет данных.

Складчатость и очаговые разрывы сарколеммы являются патоморфологическим свидетельством естественного течения процесса разрушения мембран МВ преимущественно за счет эксцентрического растяжения в условиях дефицита дисферлина, играющего ключевую роль в репарации сарколеммы [6—8]. Тем не менее подобные изменения были обнаружены при саркогликанопатии и миодистрофии Дюшенна, что свидетельствует о нарушении перераспределения механического натяжения между мембраной и внеклеточным матриксом в условиях нарушения функции дистрофин-гликопротеинового комплекса [11, 12].

Выростов сарколеммы в виде микроворсинок, о которых сообщали некоторые авторы, обнаружено не было [6, 7]. Патоморфогенез выростов сарколеммы неясен, однако подобные изменения были обнаружены при дисферлинопатии с преимущественным поражением аксиальной мускулатуры и развитием камптокормии и миопатии, вызванной дефектами COL6A1, COL6A2 и COL6A3 (миопатия Бетлема) [13, 14]. Предполагается, что выросты сарколеммы могут быть проявлением экзоцитоза аберрантно собранных сегментов мембраны [6].

Деструктивные изменения митохондрий при дисферлинопатии могут быть результатом нарушений в работе электрон-транспортной цепи, причиной которых являются дестабилизация кальциевого гомеостаза, вызванная повышенной проницаемостью сарколеммы, и, как следствие, дисфункция ферментов окислительного фосфорилирования ввиду избытка ионов Ca²⁺ [15]. Схожие ультраструктурные изменения митохондрий описаны у рыб вида Данио-рерио, нокаутных по генам SGCB и SGCD для воспроизведения модели β- и δ-саркогликанопатии, и у кальпаин-3-дефицитных мышей линии C3KO. Аналогичные изменения выявлены у пациентов с миодистрофией Дюшенна, также сопровождающейся выраженным нарушением целостности саркоплазматической мембраны [16—18].

Считается, что везикулы в областях дефектов сарколеммы образуются из лизосом и комплекса Гольджи [19]. Вероятно, скопление везикул преимущественно под поврежденной мембраной является следствием разобщения молекулярного механизма репарации в условиях дефицита дисферлина. Это предположение подтверждается экспериментальными данными, полученными при электронной микроскопии скелетных мышц мышей линий A/J и Bla/J, нокаутных по гену DYSF [20]. Несмотря на то что это ультраструктурное изменение, по данным литературы [21], является преобладающим у пациентов с дисферлинопатией, аналогичные субмикроскопические изменения описаны для МВ у пациентов с кальпаинопатией, что свидетельствует о неспецифичности данного признака, но может косвенно указывать на спектр патофизиологически связанных поражений скелетных мышц. В случае миодистрофии Дюшенна и саркогликанопатии субсарколеммальные везикулярные скопления не описаны, что подчеркивает фундаментальные различия патогенетических механизмов этих заболеваний в сравнении с дисферлинопатией и может быть использовано для дифференциальной диагностики в отдельных случаях [16, 17].

Уменьшение количества T-трубочек и саркотубулярных цистерн, биогенез которых опосредован активностью дисферлина, приводит к формированию дисфункционального варианта T-системы, препятствуя процессу электромеханического сопряжения. Увеличение глубины складок постсинаптической мембраны и расширение СПР, наблюдаемые при дисферлинопатии, могут рассматриваться как вторичные компенсаторные механизмы, направленные на частичное восстановление функции T-системы [22]. Аналогичные изменения СПР в более выраженной форме наблюдаются у пациентов при миодистрофии Дюшенна, а также в экспериментальных моделях, воспроизводящих условия саркогликанопатии [16, 17].

Некротические изменения миосателлитоцитов демонстрируют снижение регенераторного потенциала скелетной мышечной ткани, что обусловлено не только закономерным расходованием пула миосателлитоцитов в процессе физиологической регенерации, но и непосредственным повреждением сателлитных клеток [23]. Ускоренное уменьшение популяции и снижение функциональной активности миосателлитоцитов были отмечены также при миодистрофии Дюшенна [24].

Телоциты — недавно описанная популяция клеток, о вовлечении которой в тот или иной патологический процесс в скелетной мышечной ткани известно немного [25]. Некоторые исследователи [26] сообщали о наличии непосредственной морфофункциональной связи между телоцитами и миосателлитоцитами путем паракринного сигнального взаимодействия. Основываясь на экспериментальных данных о непосредственном участии телоцитов в активации миосателлитоцитов и запуске миогенной дифференцировки, можно предположить, что некроз телоцитов, ранее не описанный исследователями при дисферлинопатии, выступает в роли одного из факторов, инициирующих некроз сателлитных клеток в отсутствие необходимых факторов роста. В настоящее время механизм, обусловливающий некроз телоцитов в отсутствие дисферлина, неясен [27]. Гибель клеток стромы при генетической патологии ставит вопрос о возможном механизме. Поскольку для функционирования телоцитов тот или иной мышечный белок, судя по всему, не является критически важным, следует принять концепцию о вторичном поражении вследствие изменения профиля провоспалительных цитокинов [28].

Обнаруженные при электронной микроскопии функционально активные фибробласты связаны с распространенным фиброзом стромы. В ряде исследований показано негативное влияние интенсивной продукции коллагена I типа — основного компонента экстрацеллюлярного матрикса на пролиферацию и дифференцировку миосателлитоцитов. Также прогрессирование фиброза перепрограммирует миобласты на профиброзную функцию, запуская непрерывный самовоспроизводящийся механизм коллагеногенеза, что могло послужить фактором, способствующим некрозу миосателлитоцитов в некоторых описанных случаях [29, 30].

Заключение

Выявленные ультраструктурные изменения не являются специфичными, однако электронная микроскопия предоставляет ценную информацию для выявления новых звеньев патологического процесса, протекающего в скелетных мышцах при дисферлинопатии. Особое внимание привлекает ранее не описанный некроз миосателлитоцитов и телоцитов, что может указывать на неизвестный механизм патоморфогенеза, связанный с нарушением функционального взаимодействия клеток стромы с последующим снижением регенераторных возможностей скелетных мышц.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Чекмарева И.А., Бардаков С.Н., Деев Р.В.

Сбор и обработка материала — Чекмарева И.А., Бардаков С.Н.

Написание текста статьи — Лимаев И.С., Емелин А.М., Бардаков С.Н.

Редактирование — Деев Р.В., Бардаков С.Н.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.