Аденомиоз (генитальный внутренний эндометриоз, эндометриоз матки) характеризуется появлением эндометриоидных гетеротопий в мышечном и серозном слоях тела матки, интрамуральной части маточных труб или в шейке матки (цервикальном канале) [1, 2]. Не утратило своего значения определение аденомиоза, впервые предложенное C. Bird и соавт. в 1972 г., как «доброкачественной инвазии эндометрия в миометрий, приводящей к диффузному увеличению матки, которая микроскопически представлена эктопическими, не неоплазированными эндометриальными железами и стромой, окруженными гипертрофированным и гиперпластичным миометрием» (цит. по [1]).
Аденомиоз широко распространен и, по данным разных авторов, встречается у 8—62% женщин репродуктивного возраста, составляя более 90% от числа всех локализаций эндометриоза. Широкий разброс показателей частоты аденомиоза объясняется его нередким бессимптомным течением. Заболевание носит эстрогензависимый характер и выявляется более чем у половины женщин с бесплодием. Заболевают в основном женщины в возрасте 30—45 лет, хотя первые признаки аденомиоза могут появляться у подростков в период становления менструальной функции. С наступлением беременности или в менопаузе симптомы аденомиоза обычно регрессируют [1—3].
До настоящего времени нет единого мнения о механизмах развития аденомиоза, как и эндометриоза в целом. Ни одна из существующих теорий не объясняет всю полноту известных фактов. Хотя аденомиоз и является доброкачественным патологическим процессом, он демонстрирует инвазивный характер роста как эпителиального (за редким исключением), так и стромального компонента эктопических эндометриоидных очагов и базального слоя эутопического эндометрия с нарушением пограничного с ним слоя миометрия (пограничной пластинки) [1, 4—7].
Молекулярные механизмы, ответственные за патогенез заболевания, не установлены, но в эктопическом и эутопическом эндометрии при аденомиозе выявлены повышенная экспрессия различных факторов роста и ангиогенеза, а также патологический синтез фермента ароматазы (цитохрома Р450), приводящего к локальной гиперэстрогении за счет превращения андростендиона и тестостерона в эстрон и эстрадиол [5—11].
Повышенная инвазивная активность эндометрия при аденомиозе подтверждается увеличением продукции цинкзависимых матриксных металлопротеиназ (ММР), преимущественно желатиназ, А и B (MMP 2 и 9), эктопическим и эутопическим эндометрием с угнетением экспрессии их тканевых ингибиторов (TIMP) [5, 12—16].
При аденомиозе обнаружено высокое содержание в эктопическом и эутопическом эндометрии белка моэзина (его активной фосфорилированной формы) и соответствующей мРНК. Это позволило предположить, что гиперэкспрессия моэзина является уникальным биомаркером аденомиоза. Моэзин (moesin) — белок семейства ERM (ezrin/radixin/moesin)-протеинов, включающих также эзрин и радиксин, присутствует в клетках многих тканей, влияет на метаболизм белков цитоскелета, контролируя геометрическую форму, адгезию, межклеточное распознавание, подвижность клеток и обеспечивая процессы инвазивного роста [17—19]. Поэтому при аденомиозе представляет интерес исследование экспрессии других ключевых белков, регулирующих процессы инвазии, таких как p21-активированная киназа 4 (PAK 4), а также маркеров субпопуляций стволовых клеток, в частности СD34.
p21-активированные киназы (PAK 1—4) относятся к митогенактивируемому протеинкиназному каскаду и представляют собой семейство серин/триониновых киназ. PAK 4 рассматривают как ключевое звено сигнальных путей, регулирующих метаболизм клеточного цитоскелета, от чего зависят адгезия и подвижность клеток. Выявлена повышенная экспрессия PAK 4 при раке молочной железы, поджелудочной железы, толстой кишки и яичников. Гиперэкспрессия PAK 4 связана с прогрессией этих опухолей и их метастазированием [20—22].
CD34 — гликозилированная трансмембранная молекула адгезии клеток, которая выявляется у гемопоэтических стволовых клеток, эндотелиальных клеток и субпопуляции фибробластоподобных клеток соединительной ткани, расцениваемых как стволовые. Зрелые клетки (кроме эндотелиоцитов) теряют способность к экспрессии CD34. Этот маркер применяют для иммуногистохимического выявления эндотелия сосудов и разных субпопуляций стволовых клеток [23, 24].
Цель исследования — изучить экспрессию моэзина, PAK 4, MMP 2, MMP 9 и CD34 в эутопическом и эктопическом эндометрии при разных формах аденомиоза.
Материал и методы
Исследовали образцы эутопического и эктопического эндометрия у 50 пациенток репродуктивного и предменопаузального возраста в фазу пролиферации и раннюю фазу секреции менструального цикла с разными формами аденомиоза (основная группа). Обследовали женщин в возрасте от 21 года до 49 лет (в среднем 31±4,1 года). Матки были удалены по поводу диффузной формы аденомиоза с поражением тела матки II—IV стадии по классификации Л.В. Адамян (1992, 1998, цит. по [1]) (25 наблюдений) и аденомиом, единичных и множественных, интрамуральных и субмукозных с диаметром узлов от 1,5 до 6 см (25 наблюдений). В основную группу не включали пациенток с сопутствующими заболеваниями, а также получавших гормональную терапию за последние полгода. В группе сравнения использовали образцы эндометрия 20 маток, удаленных по поводу интрамуральных и субсерозных простых лейомиом у женщин репродуктивного и предменопаузального возраста, также в фазу пролиферации и раннюю фазу секреции менструального цикла (возраст пациенток от 29 до 52 лет, в среднем 33±5,7 года). В группу сравнения не включали наблюдения с субмукозными миомами и патологией эндометрия, а также пациенток с сопутствующими заболеваниями и получавших в последние полгода лечение гормональными препаратами.
Гистологическое исследование проводили на кафедре патологической анатомии ФГБОУ ВО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздрава России, иммуногистохимическое — в отделе патологической анатомии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр хирургии им. А.В. Вишневского» Минздрава России.
Для гистологического исследования использовали стандартный метод фиксации в 10% нейтральном формалине и заливки в парафин с окраской гистологических препаратов гематоксилином и эозином. В каждом наблюдении исследовали по 3—4 образца, взятых из тела удаленных маток на границе эндометрия и миометрия, и из разных участков миометрия (и аденомиом). Их изучение позволяло подтвердить и уточнить патогистологический диагноз, выявить эндометриоидные очаги, а также отобрать парафиновые блоки для проведения иммуногистохимического исследования.
С помощью иммуногистохимического метода изучали 50 образцов, из них 20 аденомиоза, 20 аденомиом и 10 из группы сравнения. Исследование выполняли, используя серийные срезы, изготовленные из парафиновых блоков, отобранных в ходе предварительного гистологического исследования. В качестве первичных использовали антитела к моэзину (Moesin, «GeneTex», США, в разведении 1:100), p21-активированной киназе 4 (PAK 4, «GeneTex», США, в разведении 1:100), матриксным металлопротеиназам 2 и 9 (ММР 2, MMP 9, «Lab Vision», США, в разведении 1:100) и маркеру эндотелиальных и стволовых клеток CD34 («Dako», Норвегия, в разведении 1:100).
Постановку иммуногистохимических реакций после высокотемпературного восстановления антигенных детерминант в PT-модуле для термической обработки парафиновых срезов («Thermo Scientific», Великобритания) осуществляли в аутостейнере Thermo Scientific (Великобритания) согласно протоколам, прилагаемым фирмами-изготовителями к моно- и поликлональным антителам. Для визуализации реакций применяли готовую тест-систему Histophine («Nichirei Corp.», Япония) с универсальными вторичными антителами, меченными хромогеном (3,3’-диаминобензидином). Учитывали два негативных контроля (на специфичность реакции и отсутствие активной эндогенной пероксидазы) и один внутренний позитивный на специфичность реакции.
Для количественной оценки иммуногистохимических реакций с антителами к моэзину, PAK 4, MMP 2 и MMP 9 использовали полуколичественный метод. Учитывали выраженность их экспрессии в баллах (отсутствие — 0 баллов, слабая — 1 балл, умеренная — 2 балла и выраженная — 3 балла) отдельно для эпителиальных и стромальных клеток базального слоя эутопического эндометрия и эндометриоидных очагов. Подсчет проводили в 10 случайным образом отобранных полях зрения при увеличении микроскопа 400. При оценке экспрессии CD34 имеют значение ее наличие и локализация, но не степень выраженности, в связи с чем количественный анализ экспрессии этого маркера не проводили.
Результаты морфометрического исследования обрабатывали статистически с использованием программного обеспечения MS Office Excel и Statistica для Windows 10.0, представляли в виде среднего значения и стандартного квадратического отклонения (М±σ) и применяли метод непараметрического анализа по Манну—Уитни. Величина критического уровня значимости принималась равной 0,05.
Результаты
Наблюдения данных группы сравнения показали, что во всех случаях граница базального слоя эндометрия и миометрия ровная, эндометрий не образует инвагинаций и не проникает через пограничную пластинку миометрия (рис. 1, а).
Экспрессия моэзина и PAK 4 отсутствовала или была слабовыраженная в эпителии желез (0,4±0,51; 0,3±0,32) и стромальных клетках (0,2±0,28; 0,3±0,33) базального слоя эндометрия и умеренно выраженная в эндотелии сосудов эндометрия и разных структурах миометрия (см. рис. 1, в, д). Отмечалась слабая экспрессия ММР 2 и ММР 9 в эпителии желез (0,8±0,67; 0,7±0,73) и единичных клетках стромы (0,6±0,64; 0,5±0,59), а также умеренная в эндотелии сосудов базального слоя эндометрия и во всех структурах миометрия. Экспрессия CD34 выявлялась только в эндотелии сосудов и единичных клетках стромы эндометрия и миометрия. Степень и особенности локализации экспрессии изученных маркеров не зависели от возраста женщин, морфологических особенностей простых лейомиом и фазовых изменений эндометрия (гистологически эндометрий соответствовал фазе пролиферации или ранней стадии фазы секреции менструального цикла).
Во всех наблюдениях основной группы как с диффузным аденомиозом, так и аденомиомами граница эндометрия и миометрия была неровная («зубчатая») за счет множественных очагов инвагинации и врастания базального слоя эндометрия через пограничную пластинку в толщу миометрия. Миометрий в этих участках гипертрофирован и гиперплазирован, его отдельные пучки глубоко погружались в базальный слой эндометрия (см. рис. 1, б).
В базальном слое эутопического эндометриия как при диффузной форме аденомиоза, так и аденомиомах была выражена экспрессия моэзина и РАК 4 в эпителии желез (2,4±0,45; 2,3±0,59), клетках стромы (1,3±0,86; 1,2±0,73) и эндотелии сосудов (см. рис. 1, г, е). Она многократно, в 6—7,7 раза в эпителии и в 4—6,5 раза в стромальных клетках выше, чем в базальном слое эндометрия из группы сравнения (см. таблицу). 
Экспрессия MMP 2 и MMP 9 также была выраженной в эпителии желез (2,4±0,51; 2,4±0,57), клетках стромы (2,1±0,69; 2,0±0,77), а также в эндотелии сосудов базального слоя эндометрия (см. таблицу), превышая показатели группы сравнения в 3–3,4 раза в эпителии и в 3,5—4 раза в стромальных клетках (см. рис. 1, ж). Она была умеренно выраженная также в миоцитах и экстрацеллюлярном матриксе миометрия. Экспрессия моэзина, РАК 4, MMP 2 и MMP 9 была максимальной во всех тканевых структурах в участках врастания базального слоя эндометрия в миометрий, причем как в наблюдениях аденомиоза, так и аденомиом.
Экспрессия CD34 отмечалась в эндотелии сосудов и во многих, а не единичных, как в группе сравнения, клетках стромы базального слоя эндометрия в очагах его врастания через пограничную пластинку в толщу миометрия. В миометрии различия экспрессии СD34 с группой сравнения не выявлялись (см. рис. 1, з).
Эндометриоидные очаги как при диффузной форме аденомиоза, так и в аденомиомах представлены эпителиальным и стромальным компонентами и в соответствии с общепринятыми гистологическими критериями их активности [5] преобладали (42 наблюдения, 84%) активные (растущие и стабильные), которые отличались пролиферативным или секреторным типом эпителия желез, большим количеством цитогенной стромы с обилием сосудов. Преимущественно неактивные (регрессирующие) очаги, представленные кистозно-расширенными железами с атрофичным или индифферентным эпителием, небольшим объемом и склерозом стромального компонента со слабой васкуляризацией встретились в 8 (16%) наблюдениях диффузной формы аденомиоза.
При диффузной форме аденомиоза в эктопическом эндометрии (эпителиальном и стромальном компонентах) выражена экспрессия моэзина и РАК 4 в эпителии желез (2,2±0,65; 2,1±0,66), клетках стромы (1,6±0,78; 1,4±0,58) и эндотелии сосудов, а также в эндотелии сосудов и разных структурах окружающего их миометрия (см. рис. 2, б, д). Показатели их экспрессии в эпителии в 6—7 раз и стромальных клетках в 4,7—8 раз выше, чем в группе сравнения, но достоверно не отличались от показателей эутопического эндометрия при диффузном аденомиозе и аденомиомах (см. таблицу). В неактивных эндометриоидных очагах экспрессия моэзина и РАК 4 была менее выраженной. Наблюдалась умеренная или выраженная экспрессия ММР 2 и MMP 9 в эпителиальных (2,5±0,47; 2,4±0,42) и стромальных (2,3±0,53; 2,2±0,61) клетках эндометриоидных очагов, а также в эндотелии сосудов, миоцитах и строме окружающего миометрия. Их экспрессия в эпителии в 3,0—3,1 раза и клетках стромы в 3,8—4,4 раза выше, чем в группе сравнения, но не отличалась от показателей эутопического эндометрия при диффузном аденомиозе и аденомиомах (см. таблицу). В эпителии желез с признаками секреторной трансформации и атрофии в эндометриоидных очагах ММР 2 и MMP 9 не выявлялись, а в стромальных клетках неактивных очагов их экспрессия заметно ниже.
Экспрессия CD34 в эндотелии сосудов и во многих клетках стромы эндометриоидных очагов была сходной с наблюдаемой в очагах врастания базального слоя эутопического эндометрия в миометрий. В перифокальном к очагам аденомоза миометрии экспрессия CD34 выявлялась в эндотелии сосудов и единичных фибробластоподобных клетках стромы.
В аденомиомах гистологическое строение гладкомышечного компонента соответствовало простым лейомиомам с множественными активными периваскулярными зонами роста. Эндометриоидные очаги представлены активными железистым и стромальным компонентами (см. рис. 2, а), иногда с секреторной трансформацией или умеренно выраженной атрофией эпителия и кистозным расширением части желез. Была выражена экспрессия моэзина и РАК 4 в эпителии желез (2,3±0,61; 2,2±0,58) и клетках стромы (1,7±0,72; 1,5±0,42, см. таблицу), а также в эндотелии сосудов эндометриоидных очагов, эндотелии сосудов, в части миоцитов и строме лейомиом (см. рис. 2, в, г). Экспрессия моэзина и РАК 4 в эндометриоидных очагах в эпителиальных клетках в 5,7—7,3 раза и в стромальных в 5—8,5 раза выше, чем в эндометрии группы сравнения, но статистически достоверно не отличалась от показателей эутопического и эктопического эндометрия при диффузном аденомиозе и эутопического при аденомиомах. Отмечалась более выраженная экспрессия моэзина и РАК 4 в опухолевых миоцитах и строме аденомиом, чем в окружающем их миометрии, за исключением эндотелия сосудов. Выявлялась умеренная и выраженная экспрессия ММР 2 и MMP 9 в эпителии желез (2,5±0,42; 2,6±0,50, в 3,1–3,7 раза выше, чем в группе сравнения), клетках стромы (2,4±0,36; 2,3±0,31, в 4—4,6 раза выше, чем в группе сравнения, см. таблицу) и эндотелии сосудов эндометриоидных очагов. Она достоверно не отличалась от показателей эутопического и эктопического эндометрия при диффузном аденомиозе и эутопического при аденомиомах (см. рис. 2, е, ж). Их умеренная экспрессия отмечалась также в части миоцитов и строме лейомиом, причем, как и для моэзина и PAK 4, более выраженная, чем в окружающем миометрии. В эпителии кистозно-расширенных желез с признаками секреторной трансформации экспрессия ММР 2 и MMP 9 не выявлялась.
Экспрессия CD34 наблюдалась в эндотелии сосудов и части клеток стромы эндометриоидных очагов, как и при диффузном аденомиозе, а также во многих клетках периваскулярных зон роста аденомиом, в эндотелии сосудов и отдельных клетках стромы аденомиом и окружающего миометрия (см. рис. 2, з).
Таким образом, результаты гистологического исследования показали, что как при диффузной форме аденомиоза тела матки, так и при аденомиомах независимо от фазы менструального цикла (пролиферативной или ранней стадии секреторной) у женщин репродуктивного возраста граница эндометрия с миометрием неровная, «зубчатая» за счет множественных очагов врастания стромального и железистого компонентов базального слоя эндометрия в миометрий и пучков субэндометриального слоя миометрия в эндометрий.
Результаты иммуногистохимического исследования выявили многократное, в 3—8,5 раза, по сравнению с группой сравнения повышение экспрессии моэзина, РАК 4, ММР 2 и MMP 9 в эпителии и стромальных клетках не только в эктопических эндометриоидных очагах при аденомиозе и аденомиомах, но и в базальном слое эутопического эндометрия. Достоверной разницы в экспрессии изученных ферментов между эутопическим базальным слоем эндометрия и эктопическими очагами как при аденомиозе, так и при аденомиомах не обнаружено, как и между эктопическими эндометриоидными очагами при аденомиозе и аденомиомах. Однако выявлена тенденция к повышенной экспрессии изученных ферментов в миометрии, окружающем эктопические эндометриоидные очаги при аденомиозе, а также в миоцитах и строме аденомиом.
Результаты проведенного исследования согласуются с ранее установленным фактом высокой инвазивной активности как эутопического, так и эктопического эндометрия при разных формах аденомиоза [4, 5, 18], дополнительным подтверждением этого положения является выявление повышенной экспрессии не только моэзина, ММР 2 и ММР 9, но и РАК 4, а также увеличение в строме числа клеток с маркером стволовых (CD34+).
Заключение
Для разных форм аденомиоза (диффузной и аденомиом) характерна повышенная инвазивная активность базального слоя эндометрия с множественными очагами его врастания в миометрий. Не только эктопический эндометрий при разных формах аденомиоза, но и базальный слой эутопического эндометрия отличается многократно повышенной экспрессией ферментов, обеспечивающих высокую инвазивную активность клеток – моэзина, РАК 4, ММР 2 и ММР 9, а также увеличением в строме числа клеток с маркером стволовых (CD34+). Полученные данные свидетельствуют в пользу теории патогенеза аденомиоза вследствие инвазии эутопического эндометрия в миометрий.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ (соглашение № 18−15−00−165)
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — О.В.З., Л.В.А.
Сбор и обработка материала — Л.М.М., К.Н.А., Д.В.К.
Написание текста — Л.М.М.
Редактирование — О.В.З., Л.В.А.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Сведения об авторах
Зайратьянц Олег Вадимович — д-р мед. наук, проф., зав. кафедрой патологической анатомии; e-mail: ovzair@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-3606-3823
Адамян Лейла Владимировна — https://orcid.org/0000-0003-4621-2079
Манукян Лиана Микаеловна — https://orcid.org/ 0000-0001-8395-7534
Калинин Дмитрий Валерьевич — https://orcid.org/0000-0001-6247-9481
Арсланян Карина Нориковна — https://orcid.org/0000-0001-6146-830Х