Клаудины — семейство трансмембранных белков с мол. массой 20—27 кДа, являющихся составляющей плотных контактов, которые играют ключевую роль в неопластических процессах, поскольку участвуют в формировании единого сигнального пути между внеклеточным матриксом и внутриклеточным цитоскелетом [1]. В плотных контактах злокачественных клеток часто наблюдаются структурные и функциональные аномалии, проявляющиеся в изменении уровня экспрессии различных типов клаудинов [2]. Ключевую роль в инициации и прогрессии опухоли может играть так называемая «поломка эпителиального барьера», которая включает три взаимосвязанных элемента: 1) вследствие клеточной полярности в норме функциональные рецепторы факторов роста располагаются на базолатеральной поверхности клетки, контактируя с внутриклеточной жидкостью и кровотоком; 2) факторы роста (лиганды к этим рецепторам) чаще всего накапливаются в больших концентрациях в люминальной жидкости эпителиальных тканей (с противоположной стороны); 3) нарушения в плотных контактах приводят к транспорту большого количества этих факторов через эпителиальный барьер, который в норме предотвращают плотные контакты. Данный феномен называется «lesional leak» (патологическая утечка) [3]. Таким образом, функция плотных контактов заключается в сохранении клеточной полярности за счет контроля диффузии молекул сквозь эпителиальный барьер и обеспечении адгезии клеток [4].

Семь типов клаудинов, включая клаудины 1, 3 и 4, вовлечены в туморогенез [5]. Для некоторых типов рака, например рака предстательной железы, поджелудочной железы и яичника, характерно увеличение экспрессии белков клаудин-3 и клаудин-4 [6]. Для гепатоцеллюлярной карциномы и почечной карциномы, напротив, характерно снижение уровня клаудина-4 и клаудина-5 [7, 8]. Типичной иммуногистохимической локализацией клаудинов является мембранная, однако в литературе имеются данные о цитоплазматической и даже ядерной локализации клаудинов разных типов в злокачественных опухолях. Помимо оценки выраженности реакции клаудинов 1, 3 и 4 в полипах и раке толстой кишки, цель настоящего исследования — оценить локализацию данных белков.

В работе использован операционный и биопсийный материал от 118 пациентов с новообразованиями толстой кишки. В исследование не входил материал от больных, получавших в предоперационном периоде лучевую или химиотерапию. Возраст пациентов варьировал от 30 до 86 лет (средний возраст 61,1 года).

В исследуемую выборку включены 32 случая аденокарциномы, 54 — аденомы и 32 — «зубчатых образований», согласно классификации ВОЗ 2010.

Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) проводилось с поликлональными мышиными антителами к клаудинам 1, 3, 4 (RTU, «Thermo», Англия). Депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигенов проводили при помощи буфера Dewax and HIER Buffer L («Thermo», Великобритания) при температуре 95—98 °С, рН 6,0 в течение 20 мин в модуле предобработки (PT-Module). ИГХ-реакции проводили в автоматизированном режиме с помощью автостейнера Thermo Scientific Lab Vision Autostainer 480S. Время инкубации составило 30 мин. Согласно рекомендации производителя, в качестве положительного контроля использовали рак молочной железы, тонкой кишки и рак яичника соответственно.

Из нескольких описанных систем оценки экспрессии клаудинов 1, 3 и 4 [9—11] использовали методику G. Sheehan и соавт., поскольку она является наиболее полной [12].

Интенсивность (слабая — 1 балл, умеренная — 2 балла, выраженная — 3 балла) ∙ количество прореагировавших клеток (менее 25% — 1 балл, 25—50% — 2 балла, более 51% — 3 балла) = итоговый балл (ИБ) (0—3 — слабая, 4—6 — умеренная, 7—9 — выраженная)

Дополнительно оценивали локализацию маркера.

В большинстве случаев реакция с клаудином-1 (84/118), клаудином-3 (64/118) и клаудином-4 (52/118) в раке и полипах толстой кишки имела мембранную локализацию (рис. 1, г, рис. 2, в). Однако в 33 (27,9%) наблюдениях выявлена парадоксальная реакция клаудина-1, в 50 (42,4%) — клаудина-3, в 66 (55,9%) — клаудина-4. Среди парадоксальной реакции клаудинов сравнительно редко наблюдалась ядерная локализация маркера: в 2,5% клаудина-3 и в 8,5% клаудина-4 (табл. 1).

Ядерная реакция клаудинов выявлена в аденокарциномах, в классических аденомах и в «зубчатых образованиях» толстой кишки, однако в последней группе наблюдалась лишь в зубчатых аденомах на широком основании, но не в гиперпластических полипах. Характер реакции клаудина-3 и клаудина-4 отличался в разных группах.

Парадоксальная реакция клаудина-3 выявлена в 3 случаях. В аденокарциномах на фоне отрицательной типичной реакции клаудинов в двух случаях наблюдалась парадоксальная ядерная реакция (см. рис. 1, а, б). В одном случае парадоксальная реакция выявилась в аденокарциноме низкой степени дифференцировки (см. рис. 1, а), и ни цитоплазматическая, ни типичная мембранная локализация маркера не была представлена в разрозненных опухолевых клетках. В другом случае ядерная реакция наблюдалась в аденокарциноме высокой степени дифференцировки (см. рис. 1, б). Цитоплазматическая локализация маркера не наблюдалась, а типичная мембранная была более выражена по сравнению с первым случаем (см. рис. 1, а) и выглядела как едва заметная, неполная, крайне слабая реакция. Парадоксальная реакция клаудина-3 оказалась тотальной на всем препарате.

Отчетливая парадоксальная ядерная реакция также обнаружена в одной ворсинчатой аденоме (см. рис. 1, в) на фоне умеренной мембранной и слабой цитоплазматической реакции.

Парадоксальная ядерная реакция клаудина-4 выявлена в 10 случаях: в 5 классических аденомах и 5 «зубчатых образованиях». Отличительной особенностью данной реакции от клаудина-3 являлось ее наличие на фоне выраженной мембранной и цитоплазматической реакции клаудина-4 во всех наблюдениях. Также особенностью клаудина-4 оказалась очаговая реакция в ядрах: ни в одном препарате не было реакции клаудина-4 в каждом ядре опухолевой клетки. Во всех случаях с описанной ядерной реакцией на большей площади полипа ядра оказались интактными и только в одном или нескольких фокусах, помимо мембранной и цитоплазматической локализации маркера, наблюдалось отчетливое прокрашивание ядер. Очаговость ядерной реакции наблюдалась преимущественно в верхних отделах тубулярных структур, обращенных к просвету. На рис. 2, а отмечаются выраженная мембранная и цитоплазматическая реакция клаудина-4, наличие ядерной реакции по центру и в нижней части микрофото и отсутствие таковой в верхней части в том же поле зрения. Также обращаем внимание на интактные гематоксилиновые ядра при выраженной мембранной и цитоплазматической реакции на рис. 2, в (см. рис. 2, а). Выраженная реакция сохраняла мембранный характер в лимфоидной ткани, которая является внутренним контролем клаудина-4: при этом все ядра оставались интактными.

Технические ошибки при проведении ИГХ-исследования возможны, однако они максимально были исключены: реакции с препаратами, где появилась парадоксальная ядерная экспрессия, переставлены повторно с обязательным наличием контроля и других полипов из тех же групп в загрузке. Объяснить данный результат повреждением материала и префиксационными изменениями также затруднительно, поскольку все реакции со всеми антителами по каждому случаю проводились с одного блока, ввиду чего при повреждении материала и парадоксальной реакции клаудинов велика вероятность каких-либо нарушений в других реакциях не менее чувствительных маркеров. Также очаговость реакции клаудина-4 не может соответствовать очаговому дефекту материала, но может быть связана с генетическими нарушениями, происходящими в конкретном кластере опухолевых клеток, вследствие чего считаем необходимым обратить внимание на данный феномен.

Плотные контакты (tight junction) — межклеточные эпителиальные контакты, расположенные преимущественно на апикальной поверхности клеток и осуществляющие барьерную функцию, регулируя поток молекул и ионов из межклеточного вещества через цитоплазматическую мембрану. Нарушения в плотных контактах наблюдаются при многих патологических состояниях, таких как заболевания почек, воспалительная болезнь толстого кишечника, отек легких, диарея, желтуха [3]. Также имеются данные о роли плотных контактов в регуляции дифференцировки и пролиферации клеток [13].

В комплекс плотных контактов входят три группы белков: интегральные (трансмембранные), каркасные (scaffolding proteins) и сигнальные (табл. 2). Группа трансмембранных белков, экстрацеллюлярный домен которых достигает парацеллюлярного пространства, представлена двумя типами в зависимости от количества внутримембранных петель [14]. К белкам, содержащим четыре петли, относятся клаудины, окклюдины, трицеллюлин. К белкам, содержащим одну петлю, — межклеточные молекулы адгезии (JAM) и Коксаки аденовирус-ассоциированный рецептор (CAR).

Каркасные белки представляют собой бляшку из сети периферических белков, соединяющих интегральные протеины с сигнальными белками, и подлежащим актиновым цитоскелетом. Самым распространенным примером является запирающая зона (zona occludens, ZO) — ZO-1, ZO-2, ZO-3. относящимся к мембраноассоциированным гуанилаткиназоподобным гомологам [15]. Каркасные белки со стороны N-конца взаимодействуют с трансмембранными белками через PDZ-домен, со стороны C-конца — с сигнальными белками (транскрипционными факторами, киназами и фосфатазами) и актиновым цитоскелетом [16]. Каркасные белки, такие как ZO-1, ингибируют клеточную пролиферацию путем связывания белка ZONAB (ZO-1 associated nucleic acid binding protein), тем самым предотвращая его движение в ядро (рис. 3) [13].

Клаудины — семейство трансмембранных белков, которые четыре раза пронизывают мембрану и формируют две экстрацеллюлярные петли, одну внутрицеллюлярную петлю, C- и N-концевые цитоплазматические домены [17]. Экстрацеллюлярные петли регулируют парацеллюлярную проницаемость и участвуют в формировании плотных контактов, которые играют важную роль в поддержании целостности эпителиального пласта. За исключением клаудина-12, все члены семейства имеют цитоплазматический С-конец с дипептидной последовательностью YV. Эта последовательность позволяет связываться с другими белками, содержащими PDZ-домены (ZO-1, ZO-2, ZO-3 и MUPP1) (см. рис. 3) [18].

Наиболее изученным среди клаудинов, в том числе и в отношении транслокации в цитоплазму и ядро, является клаудин-1. Наличие клаудина-1 в ядре описано в литературе в раке толстой кишки, остеосаркоме, меланоме и доброкачественных невусах, однако публикации немногочисленны (табл. 3).

В единственной публикации M. Todd и соавт., посвященной ядерной экспрессии клаудина-3 в клеточных линиях рака молочной железы, сообщается, что мембранная и ядерные фракции клаудина-3 имели одинаковую молекулярную массу 23 кДа, а цитоплазматическая содержала еще дополнительный «урезанный» вариант данного маркера [25]. Публикаций относительно ядерной экспрессии клаудина 3 и 4 значительно меньше, чем клаудина-1, однако, поскольку механизмы данной транслокации остаются не ясны, а причины ядерной реакции клаудина-1 и клаудинов других типов могут быть общими или схожими, принимаем во внимание рассуждения других авторов по всем типам клаудинов. Также обращаем внимание, что в литературе имеются данные о ядерной локализации клаудинов не только в злокачественных опухолях, но и в доброкачественных невусах [24], что позволяет сравнивать эти данные с нашими не только для рака толстой кишки, но и для полипов.

По данным авторов, транслокация клаудинов в цитоплазму и особенно в ядро происходит при увеличении подвижности опухолевых клеток и повышается при отсутствии K8/18-цитоскелета [21]. Выдвинута гипотеза о том, что PDZ-связывающий компонент C-конца клаудинов является структурным компонентом, обусловливающим их корректную локализацию [26]. Однако было показано, что клаудин-1 с мутацией в PDZ-домене по-прежнему встроен в апикальную поверхность плотных контактов [27]. Тем не менее полное удаление C-хвоста клаудина привело к его транслокации в цитоплазму, доказывая, что именно цитоплазматический ближайший к мембране регион, но не PDZ-связывающий домен является необходимой структурой для правильной локализации клаудина-1 в плотных контактах [27]. Более того, позже обнаружено, что карбоксильный конец содержит большое количество мест фосфорилирования, которые и могут обусловливать описанное явление (рис. 4) [28, 29]. Мутация в сайте фосфорилирования протеинкиназы, А или «имитирование» длительного фосфорилирования вышеописанных сайтов вызывает транслокацию клаудина-1 в ядро в клетках меланомы [22]. Для установления связи между ядерной локализацией клаудина-1 и способностью к инвазии в клетки меланомы был встроен вектор, имеющий последовательность сигнала внутриядерной локализации (NLS) [22]. Однако после трансфекции наблюдалась не только ядерная, но и цитоплазматическая локализация маркера.

Основным способом транспорта белков в ядро является наличие последовательности NLS в его последовательности. Известно, что клаудин-1, равно как и клаудин-3 и клаудин-4, не имеет клеточного NLS, в связи с чем формально в ядро попасть не может. Хотя последовательности NLS и являются основными типами элементов импорта в ядро, другие последовательности, такие как PDZ-домены, также необходимы для ориентации белка в ядро. PDZ-домены в клаудинах отсутствуют, однако все члены семейства, за исключением клаудина-12, имеют внутриклеточный С-конец с дипептидной последовательностью YV, которая позволяет связываться с другими белками, содержащими PDZ-домены на N-конце [18]. К таким белкам относят ZO-1, ZO-2, ZO-3 и мульти-PDZ-домен протеин 1 (MUPP1) — мембраноассоциированные гуанилаткиназоподобные гомологи, имеющие, помимо PDZ-домена на N-конце, SH3-домен и взаимодействующие C-концом с актином цитоскелета [15]. Ингибирование этого домена не влияет на локализацию клаудина в плотных контактах, однако приводит к нарушению взаимодействия с белками ZO-1, ZO-2 и ZO-3 [30]. Поэтому один из потенциальных механизмов, посредством которого клаудин-1 может перемещаться в ядро, — взаимодействие с ZO-1 или ZO-2, аналогично с Armadillorepeat gene deleted in Velo-cardio-facial syndrome (ARVCF), членом семейства p120. Взаимодействие ARVCF с ZO-2 посредством связывания с PDZ-доменом приводит к транслокации ARVCF в ядро [31]. Другими примерами транслокации белков в ядро независимо от NLS являются опухолевые супрессоры, такие как APC и BRCA1 [32]. Еще один потенциальный механизм, с помощью которого клаудин-1 может попадать в ядро, — использование шаперонов или других вспомогательных белков, таких как импортин-β [33].

Известно, что ядерная локализация некоторых белков клеточных контактов (β-катенин, ZO-1, ZO-2) коррелирует с онкогенной трансформацией и пролиферацией клеток. β-Катенин — компонент адгезивных контактов — имеет двоякую роль: является молекулой клеточной адгезии, локализованной на мембране, и молекулой сигнальной трансдукции, приводя к эпителиально-мезенхимальной трансформации при локализации в цитоплазме или ядре [18]. Белок плотных контактов ZO-1 локализуется на цитоплазматической стороне плотных контактов, но не в самой клеточной мембране, в дифференцированных полярных эпителиальных клетках и транслоцируется в цитоплазму или ядро в пролиферирующих или дедифференцированных клетках [3, 34]. Мутация в ZO-1 также приводит к его транслокации и индукции эпителиально-мезенхимальной трансформации в клетках I почки собаки Madin-Darby [35].

Активация Ras- или Ras-опосредованного сигнального пути — один из инициирующих этапов туморогенеза, связанный с неопластической трансформацией. В клеточных культурах с повышенной экспрессией Ras-белки плотных контактов клаудин-1, окклюдин и ZO-1 отсутствовали в контактах клетка—клетка, зато наблюдались в цитоплазме [3].

Предлагаем две версии, объясняющие наличие ядерной реакции клаудина 3 и 4.

1. Несмотря на отсутствие в этих белках последовательности NLS, в них есть последовательности, напоминающие NLS с некоторыми поправками. Возможно, мутация или последовательность мутаций приводит к приобретению последовательности NLS, позволяющей белкам проникать в ядро.

2. Существуют онкогенные вирусы, содержащие последовательности NLS, которые, возможно, встраиваются в клетки толстой кишки, вызывая развитие опухоли (полипа). Благодаря появлению этой последовательности нарушаются функционирование белков плотных контактов и их транслокация сначала в цитоплазму, а затем в ядро.

В пользу последней свидетельствуют факты, касающиеся роли белков плотных контактов, в том числе клаудинов, в захвате различных вирусов в клетку [36]. Так, клаудин-1 ответствен за внедрение вируса гепатита C в клетку, несмотря на то что не связывается с ним. Мутации в первой экстрацеллюлярной петле клаудина-1, приводящие к разъединению контакта клетка-клетка, позволяют проникать вирусу внутрь. Есть данные о роли белка клаудина-1 и ZO-1 в проникновении вируса Денге, ротавируса и многих вирусов, вызывающих острые респираторные вирусные инфекции [36].

О цитоплазматической и ядерной локализации клаудинов разных типов сообщается в немногочисленных зарубежных работах. Причины данной транслокации остаются неизвестными, однако данный феномен вряд ли является артифициальным. Нами впервые показана ядерная реакция клаудина-3 в раке толстой кишки и ядерная реакция клаудина-4 в доброкачественных полипах толстой кишки.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Н.А.О.

Сбор и обработка материала: Н.А.О., О.А.Х.

Статистическая обработка: О.А.Х.

Написание текста: Н.А.О.

Редактирование: П.Г.М., Н.В.Д.

Конфликтинтересовотсутствует.