Список сокращений

GDNF — нейротрофический фактор глиальной клеточной линии (glial cell-derived neurotrophic factor)

PCNA — ядерный антиген пролиферирующих клеток (Proliferating cell nuclear antigen)

Gas1 — Специфическая задержка роста1 (Growth Arrest Specific Protein 1)

GFRa1 — рецептор семейства GDNF альфа 1, связанный с гликозилфосфатидилинозитолом (Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor Receptor Alpha 1)

RET — рецептор тирозинкиназы (tyrosine kinase)

NCAM — молекула адгезии нервных клеток(Neural Cell Adhesion Molecule)

NRP-1 — нейропилин-1 (Neuropilin-1)

VEGF — фактор роста эндотелия сосудов (Vascular Endothelial Growth Factor)

PP1 — пиразолопиримидин-1

MAPK — митоген-активируемая протеинкиназа (Mitogen Activated Protein Kinase)

ERK — киназа, регулируемая внеклеточным сигналом (Extracellular Signal Regulated Kinase)

JNK — c-Jun N-концевая киназа

OB — обонятельная луковица (bulbus olfactorius)

MMPs — матриксная металлопротеиназа (Matrix Metalloproteinase)

GFAP — глиальный фибриллярный кислый протеин (Glial Fibrillary Acidic Protein)

BCNU — 1, 3-бис-(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевина

CREB — белок, связывающий элемент ответа цАМФ (cAMP response element-binding protein)

Введение

Нейротрофические факторы на сегодняшний день являются самыми мощными медиаторами выживания нейронов и стимуляции их дифференцировки, поэтому существует перспектива их использования в качестве терапевтических агентов в борьбе с нейродегенеративными заболеваниями. Выполняя физиологические функции, нейротрофические факторы могут быть полезны при лечении дегенерации нервных клеток или потери дифференцировочного потенциала, что характерно при ряде расстройств центральной и периферической нервной системы. Особое внимание в изучении нейротрофических факторов уделяют глиальному нейротрофическому фактору (glial cell-derived neurotrophic factor, GDNF). GDNF был идентифицирован в среде, кондиционированной глиальной клеточной линией. Было обнаружено, что GDNF способен содействовать выживанию и увеличению размера нейральных клеток и образованию определенной длины нейритов мезенцефалических дофаминергических нейронов in vitro [1, 2].

GDNF первоначально считали селективным фактором выживания для нигростриарных дофаминергических нейронов. Это обусловлено его позитивным влиянием на трофику и жизнеспособность мезэнцефалических дофаминергических нейронов, массовая гибель которых наблюдается при социально значимом нейродегенеративном заболевании — болезни Паркинсона [3, 4]. Однако эффекты, обусловленные GDNF, этим не исчерпываются. Дополнительные исследования показали, что GDNF также поддерживает выживание мотонейронов спинного мозга [5] и норадренергических нейронов мозга [6], а также стимулирует выживание и дифференцировку нейронов спинальных ганглиев и некоторых периферических нейронов [7, 8]. GDNF также способствует поддержанию моторных, симпатических, парасимпатических, сенсорных и энтеральных нейронов и регулирует развитие почек и сперматогенез за пределами нервной системы [9, 10].

Интенсивное изучение GDNF выявило большое разнообразие его изоформ, имеющих особенности в секреции, а также большое количество рецепторных комплексов, на которые он влияет и вариантов этого влияния. Тем не менее многие свойства и характеристики синтеза, секреции, рецепторных взаимодействий и сигналинга с участием GDNF остаются невыясненными и требуют дальнейшего изучения. Одним из важнейших направлений является исследование роли GDNF в развитии и росте глиальных опухолей.

Неоднократно сообщалось о его высокой экспрессии в клеточных линиях высокозлокачественной глиомы, включая клеточную линию глиобластомы крысы C6 [11] и человека U87 [12] и U251 [13]. Было показано, что ткани глиальных опухолей, даже в самой дедифференцированной форме глиобластомы, экспрессируют GDNF в концентрациях до 5 раз выше по сравнению с нормальным человеческим мозгом [14]. Эта избыточная экспрессия GDNF может повышать пролиферацию глиальных опухолей у человека. Пролиферативный эффект GDNF был подтвержден на линии клеток крысиной глиомы C6. Добавление фактора в среду повышало процент клеток в S-фазе и экспрессию циклинов ядерного антигена пролиферирующих клеток (Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA) и Ki67 [15]. Показано также митогенное действие GDNF на нейробластому [16]. На первичных культурах глиомы человека установлено, что Gas1 белок ингибирует рост глиом, блокируя сигнальный путь GDNF-RET (tyrosine kinase, рецептор тирозинкиназы) [17, 18].

Сигнальный путь GDNF, как и других лигандов этого семейства нейротрофических факторов, опосредуется рецепторным комплексом, который включает молекулу glycosylphosphatidyl-inositol-linked GDNF рецептор семейства альфа 1 (Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor Receptor Alpha 1, GFRa1) GFRα1 и корецепторы RET или молекулу адгезии нервных клеток (Neural Cell Adhesion Molecule, NCAM) [19]. В свое время усиленная экспрессия в глиомах была доказана не только для GDNF, но и для его рецептора GFRα1 [14, 20].

Было показано существование GFRa1 двух высоко гомологичных изоформ — GFRa1a и GFRa1b, — которые отличаются пятью аминокислотами (140DVFQQ144) [21, 22]. При исследовании образцов тканей глиом и линий глиом человека с помощью изоформ-специфического real-time PCR, было установлено, что GFRa1b является преобладающей сплайс изоформой рецептора GDNF, а RET9 является преобладающим корецептором. В глиомах показана дифференциальная суперэкспрессия GFRa1b сплайс изоформы по сравнению с GFRa1a сплайс вариантом [20].

Недавно S. Sun и соавт. сообщили о новом рецепторе GDNF — нейропилине-1 (Neuropilin-1, NRP-1), — который высоко экспрессируется в глиоме и может способствовать ее росту. Этот комплекс GDNF-NRP-1 рецептор-лиганд опосредован 8 Н-связями [23]. NRP-1 в значительно большей степени экспрессируется в клетках глиомы, чем в нормальных клетках мозга [24], и может опосредовать ее прогрессирование за счет ангиогенных эффектов. Это возможно благодаря способности NRP-1 повышать ангиогенез посредством усиления взаимодействия между VEGF165 (Vascular Endothelial Growth Factor — фактор роста эндотелия сосудов) и его рецептором VEGFR2 и улучшения передачи сигналов VEGF-VEGFR2 [25]. Нокдаун по NRP-1 с помощью РНК-интерференции (RNAi) в клетках, C6 приводил к снижению эффекта повышения пролиферации под влиянием GDNF [23]. Важно отметить, что NRP-1 является независимым фактором риска глиобластомы, поскольку более высокая экспрессия NRP-1 связана с плохой выживаемостью пациентов и ранним рецидивом. Оказалось, что добавление экзогенного GDNF к клеткам глиомы увеличивает NRP-1 как на уровне белка, так и на уровне мРНК [23]. Примечательно, что существуют перекрестные связи между GDNF или его предполагаемыми рецепторами (NCAM/RET) и семейством семафоринов/VEGF, которые также являются возможными лигандами NRP-1 [23].

GDNF влияет на столь же опасные, как и пролиферация свойства глиом. В центральной нервной системе GDNF участвует в миграции нервных клеток. В частности, он может способствовать направленному движению нейробластов к обонятельной луковице (OB) в ростральном миграционном потоке (RMS) [26]. GDNF непосредственно участвует в миграции шванновских клеток [27]. Кроме того, GDNF также существенно увеличивает подвижность клеток глиомы. По данным A. Shabtay-Orbach и соавт., среда, кондиционированная астроцитами, значительно увеличивала способность к миграции линейных клеток человеческой (T98G) и мышиной (GL261) глиом по сравнению с контрольными культурами. Но этот эффект ингибировался, когда активность GDNF на клетках глиомы блокировалась химерным белком RET-Fc или антителами против GDNF, а также малой интерферирующей РНК, направленной против экспрессии GDNF астроцитами. Инкубация клеток с нормальными астроцитами приводила к зависимому от времени фосфорилированию рецептора GDNF, RET и последующей активации AKT. Способность к миграции клеток глиомы и активация RET ингибировались низкомолекулярным ингибитором RET пиразолопиримидином-1 (PP1) и ингибитором AKT LY294002. Наконец, блокирование RET с помощью интраперитонеального введения PP1 или нокаут корецептора RET GFRalpha1 в клетках глиомы уменьшало размер опухолей головного мозга у иммунокомпетентных мышей после интрацеребрального введения клеток линии GL261 [28].

Исследования in vitro показали, что GDNF усиливает миграцию линейных клеток глиомы посредством увеличения синтеза ММР-13 и в основном регулируется MEK/ERK и JNK, C-Jun и AP-1 путями [29]. Сообщалось, что некоторые сигнальные молекулы, участвующие в инвазии и миграции глиомы, такие как митоген-активируемая протеинкиназа (Mitogen Activated Protein Kinase, MAPK) [30], включающие ERK [31], JNK [32] и P38 MAPK, или матриксные металлопротеиназы (Matrix Metalloproteinase, MMPs) [29], играют решающую роль в миграции и инвазии клеток глиомы посредством непрямой или прямой активации GDNF путей MEK/ERK и JNK, c-Jun и AP-1. GDNF также способствует миграции LGG через сигнальные пути JNK и ERK [33].

Показано, что влияние GDNF на миграцию клеток опосредовано рецептором GFRa1b. Миграцию клеток глиомы GFRa1b усиливает через сигнальный комплекс GDNF-GFIa1b-NCAM. Кроме того GFRa1b регулирует экспрессию малой GTPase RhoA, которая необходима для миграции клеток С6 [34].

Известна также роль GDNF как атрактанта различных типов клеток. Так, в нормальном переднем мозге мышей GDNF является прямым хемоаттрактантным фактором для нейробластов, мигрирующих вдоль переднего миграционного пути из субвентрикулярной области в OB. В этом процессе в качестве корецептора участвует NCAM [26]. Выявлена также роль секретируемого клетками глиомы GDNF в привлечении микроглии. В этом случае микроглия не атакует клетки глиомы, а способствует ее развитию. Были созданы носители, которые содержали совокупность клеток глиомы мышей GL261 и/или клеток глиомы человека, особенностью этих носителей была их доступность для белков, но непроницаемость для клеток. Исследования на мышах показали, что имплантация этих носителей в мышиный мозг, привлекает микроглию и повышает иммунореактивность на маркер астроглиоза глиального фибриллярного кислого протеина (Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP). Снижение экспрессии GDNF с помощью siRNA в клетках GL261 глиомы мышей уменьшает привлечение микроглии. Если имплантировали клетки глиомы GL261, нокаутированные по GDNF с помощью shRNA, рост опухоли замедлялся. Исследование миграции клеток микроглии in vitro подтвердило, что GDNF является сильным хемоаттрактантом для них [35].

Не менее значимой может оказаться активность GDNF, приводящая к устойчивости клеток глиом к действию химиотерапевтических лекарств. Предварительное добавление в среду GDNF при культивировании линий клеток глиобластомы LN-229 и A172 способствовало химической устойчивости к химиотерапевтическому препарату 1,3-бис-(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевины (BCNU). Это обусловлено способностью GDNF содействовать AKT активности и ингибировать активность JNK, что в свою очередь может приводить к увеличению клеточной выживаемости после BCNU-химиотерапии [17].

В упомянутых выше работах не было выяснено, какая изоформа GDNF повышенно экспрессируется в глиомах головного мозга человека. Это может иметь значение для диагностики и прогноза лечения больных этим опасным заболеванием. Известно, что при некоторых патологиях мозга экспрессия определенных изоформ GDNF начинает преобладать над другими изоформами. Так, например, в средневисочной извилине (MTG) пациентов с болезнью Альцгеймера экспрессия зрелого GDNF пептида подавлялась, при этом экспрессия транскрипта 2-го экзона GDNF была повышенной, а экспрессия транскрипта 1-го экзона оставалась неизменной в сравнении с нормальным контролем. В противоположность этому, зрелый GDNF-пептид и уровень его мРНК изоформы не были изменены в MTG пациентов с болезнью Гентингтона [36]. Найдены также различия в динамике экспрессии α- и β-изоформ GDNF в нижних бугорках четверохолмия после аудиогенного эпилептического припадка у крыс линии Крушинского—Молодкиной [37].

Открытие новых GDNF изоформ и различия в их экспрессии в ткани глиом в головном мозге может служить диагностическим и прогностическим признаком. Эти исследования могут дополнительно выявить роль эндогенных GDNF в глиомах мозга человека.

При исследовании причин высокой экспрессии GDNF в глиомах не было обнаружено изменений в количестве копий ДНК или мутаций в промоторах и кодирующих последовательностях. Таким образом, аномально высокая транскрипция GDNF в глиомах не связана с генными мутациями [38]. Интенсивное изучение этого вопроса показало, что повышенной экспрессии GDNF способствуют эпигенетические модификации ДНК [38—40]. Более 10 лет назад S. Uchida с соавт. сообщили, что экспрессия GDNF синергетически регулируется метилированием ДНК и различными модификациями гистонов в разных областях мозга мышей [41]. Исследование причин повышенной экспрессии GDNF в глиальных опухолях мозга показало, что она обусловлена эпигенетическими изменениями в промоторных областях гена GDNF. GDNF представляет собой ген с двойным промотором, и промотор II с двумя энхансерами и двумя сайленсерами играет важную роль в инициации транскрипции. Было показано, что аномальные эпигенетические модификации в клетках глиобластомы влияют на связывание факторов транскрипции с промотором II GDNF [38, 42]. Было также продемонстрировано, что изменения в связывающей способности транскрипционных факторов обусловлены изменениями метилирования ДНК в области промотора, а также ацетилирования гистонов в этой области [38, 42, 43].

В связи с этим большое значение в управлении экспрессией GDNF имеет чувствительный к метилированию фактор ядерной транскрипции протоонкоген CREB — белок, который связывается с цАМФ в промоторе.

CRE были найдены как в энхансере, так и в сайленсере промотора II GDNF [44]. B Zhang и соавт. исследовали экспрессию CREB в тканях глиомы различных степеней злокачественности и в клеточных линиях глиомы. Было показано, что экспрессия GDNF уменьшалась при нокдауне по CREB и увеличивалась при усилении его экспрессии. CREB связывается с CRE как в энхансере II, так и в сайленсере II. Транскрипция GDNF значительно увеличивается при делеции CRE в сайленсере II и уменьшается при делеции в энхансере II. Высокое метилирование снижает связывание CREB с CRE в сайленсере II и увеличивает его в энхансере II, способствуя тем самым транскрипции GDNF. Другой причиной усиления экспрессии GDNF в глиомах может служить ацетилирование гистонов в промоторе II. Транскрипционный коактиватор CBP (CREB binding protein), обладающий гистон-ацетилазной активностью, высоко экспрессируется в клетках глиобластомы. Он связывается с фосфорилированным CREB и рекрутируется на CRE энхансера II GDNF. Таким образом B. Zhang и соавт. подтвердили свое предположение, что метилирование ДНК и ацетилирование гистонов могут синергически регулировать высокий уровень транскрипции GDNF посредством аномального связывания транскрипционных факторов [45].

Полученные знания позволяют надеяться на разработку эффективной терапии для снижения экспрессии GDNF. Известно, что малые двухцепочечные РНК (дцРНК) могут подавлять или активировать транскрипцию генов путем связывания с промоторными областями генов-мишеней [46]. В ходе продолжения работы по исследованию промоторной области GDNF были получены и исследованы 6 двухцепочечных РНК (dsRNA), нацеленных на энхансер или сайленсер в промоторе II гена GDNF [47]. Было проверено их влияние на транскрипцию GDNF и прогрессирование GBM. В результате получилось, что dsRNA, нацеленная на энхансер II, ингибировала пролиферацию клеток линии U251 из глиобластомы человека путем подавления GDNF. При этом экспрессия GDNF, а также пролиферативная и миграционная активность у нормальных астроцитов не менялась. dsRNA, нацеленная на сайленсер II, напротив потенцировала пролиферацию клеток U251.

К сожалению, пока не найдено иных способов снижения экспрессии GDNF, пригодных для использования в выработке новых антиглиомных терапевтических препаратов. Однако существует несколько веществ, которые могут повышать экспрессию GDNF и при этом рассматриваются потенциально пригодными для терапии глиом. Примером может служить вальпроевая кислота (Valproic acid — VPA), которая более века используется как эффективный противоэпилептический препарат [48]. Было показано, что VPA — один из наиболее распространенных ингибиторов гистондеацетилазы (HDACI) — оказывает прямое или синергетическое ингибирующее действие на глиому in vitro и in vivo [49, 50]. Вместе с тем VPA, обладая нейропротекторной активностью, вызывает увеличение экспрессии GDNF как in vitro [51, 52], так и in vivo [53]. Другим примером может служить мелатонин, про который установлено, что в экспериментах in vitro при добавлении к культуре клеток C6 он стимулирует экспрессию РНК GDNF [54]. Про мелатонин также известно, что в сочетании с радикальной или адъювантной лучевой терапией при неизлечимой глиобластоме, он существенно увеличивал продолжительность выживания по сравнению с одной лучевой терапией [55].

Пока остается неясным, каким образом связаны антиглиомная активность мелатонина и VPA и увеличение экспрессии GDNF. Ослабляет ли возрастание экспрессии GDNF антиглиомное воздействие. Если да, то нельзя ли усилить их терапевтическое влияние на глиому дополнительным ингибированием экспрессии GDNF.

Однако становится понятным, что GDNF, обладающий широким диапазоном действия на жизнеспособность, дифференцировку, пролиферативную активность и миграцию клеток может действовать в тех же направлениях как в нормальной нервной системе, так и в глиальных опухолях. И если при нейродегенеративных заболеваниях его применение потенциально продуктивно, то при онкологических заболеваниях и глиоме, в частности, оно может ускорить развитие опухолей. Дальнейшее изучение особенностей экспрессии и функционирования различных изоформ GDNF в глиальных и иных интрацеребральных опухолях может помочь в разработке новых методов лечения этих опасных заболеваний.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение№075-15-2020-809, вн. номер 13.1902.21.0030).

Участие авторов: Концепция и дизайн исследования — Ревищин А.В., Павлова Г.В. Сбор и обработка материала — Ревищин А.В., Паршина В.В. Написание текста — Ревищин А.В., Павлова Г.В. Редактирование — Павлова Г.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Комментарий

Нейротрофический фактор глиальной клеточной линии (GDNF) — один из наиболее изученных трофических факторов. Повышенное внимание к GDNF обусловлено его хорошо известным позитивным влиянием на жизнеспособность нервных клеток, которое может быть использовано для разработки терапевтических препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний и травм головного мозга. Однако недавние исследования показали, что трофическое влияние этого фактора распространяется не только на здоровые нервные клетки, но и на клетки опасных опухолей головного мозга. Статья представляет собой обзор литературы, посвященной роли GDNF в развитии и росте глиальных опухолей мозга — опаснейших заболеваний человека. На основе новейших данных впервые на русском языке рассмотрен ряд вопросов, связанных с эпигенетической регуляцией аномально высокой экспрессии GDNF в глиальных опухолях. Подробно изложены аспекты влияния GDNF на повышение пролиферативной и миграционной активности опухолевых клеток, а также их устойчивости к действию терапевтических противоопухолевых препаратов. Убедительно показана необходимость дальнейшего изучения влияния различных изоформ GDNF на опухоли и возможности разработки противоопухолевых препаратов на основе подавления экспрессии GDNF. Статья представляет большой интерес для читателей, интересующихся процессами развития опухолей головного мозга.

В.М. Ковальзон (Москва)