Несмотря на распространенность исследований, направленных на выявление ассоциаций однонуклеотидных полиморфизмов последовательности ДНК (ОНП) с индивидуальной предрасположенностью к развитию многофакторных фенотипических особенностей, на сегодняшний день не существует перечня геномных биомаркеров, позволяющих прогнозировать риски развития индивидуальной реакции на воздействие экстремальных факторов труда и определяющих адаптацию к различным нейропсихическим расстройствам. Анализ генетических механизмов регуляции нейрофизиологических процессов позволяет проводить селекцию отдельных молекулярно-генетических маркеров, руководствуясь принципами значимости их ассоциации с изучаемым многофакторным признаком и функциональности для его реализации. При этом в настоящее время существует большая вариативность в оценках генетических коррелятов нейропсихических особенностей и поведенческих реакций.
В данной работе проведен анализ полиморфных локусов генов, продукты которых принимают непосредственное участие в молекулярных механизмах регуляции нейрофизиологических процессов. Один из основных нейромедиаторов — серотонин (5-гидрокситриптамин) связан с эмоциональным состоянием, половым поведением, суточными ритмами, познанием и восприятием боли. Серотониновые рецепторы 2A типа (HTR2A) являются важным звеном в патогенезе различных психических расстройств. Исследователи обнаружили, что некоторые полиморфизмы данного гена, в частности rs6311 и rs6313, связаны с увеличением риска развития шизофрении и депрессии. Аллель A полиморфизма rs7997012 оказалась ассоциирована с ответом на терапию антидепрессантами [1].
Многочисленные ассоциативные исследования указывают на наличие взаимосвязи однонуклеотидных замен в гене цилиарного нейротрофического фактора (CNTF) с расстройствами аутистического спектра, умственной отсталостью, болезнями Гентингтона и Альцгеймера [2—4]. Это связано с тем, что ген CNTF оказывает плейотропное нейропротективное и нейровоспалительное действие.
В работах, посвященных изучению молекулярных основ патогенеза некоторых психических расстройств человека, оценивается роль UCP2 — гена разобщающего белка 2, который выполняет функцию митохондриального транспортера и связан с наработкой активных форм кислорода [5]. Была показана повышенная экспрессия UCP2 на периферии очагов ишемического инсульта [6]. Это указывает на взаимосвязь между митохондриальной функцией UCP2, производством активных форм кислорода и нейродегенеративными процессами [7].
Метилентетрагидрофолатредуктаза (MTHFR) — внутриклеточный фермент, который кодируется геном MTHFR и играет ключевую роль в метаболизме фолиевой кислоты, которая в свою очередь участвует в цикле метилирования и биосинтеза ДНК и РНК, пролиферации и дифференцировки нервных стволовых клеток, регуляции и экспрессии генов, синтезе нейротрасмиттеров, синтезе и восстановлении миелина [8—10]. Ее дефицит связан с риском развития многих психических и неврологических расстройств — расстройства аутистического спектра, синдрома дефицита внимания и гиперактивности, шизофрении и др. [11]. Была показана роль генетических полиморфизмов, связанных с уровнем фолатов в организме человека, в этиологии идиопатической интеллектуальной недостаточности [12, 13]. Известно около 20 мутаций гена MTHFR, нарушающих функцию фермента, при этом ряд ОНП, в том числе rs1801133 и rs18011131, рассматривается как генетические факторы предрасположенности к психическим расстройствам [14]. Также отмечена взаимосвязь полиморфных вариантов генов метионинсинтазы (MTR) и метионинсинтазы редуктазы (MTRR) с дефицитом витамина B12 и развития у пациентов рассеянного склероза и болезни Альцгеймера с поздним началом [15, 16].
В развитие ряда психоневрологических заболеваний вносят свой вклад полиморфные изменения гена ACE, кодирующего ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2/АПФ2). Отмечается ассоциация полиморфизмов гена ACE с риском развития депрессивного расстройства и суицидального поведения [17]. При этом выявлена взаимосвязь вариабельных позиций нуклеотидной последовательности ACE с риском развития нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера [18].
Потребность нейронов в энергии задействует митохондрии клеток, и дисфункция митохондриального энергетического метаболизма приводит к снижению выработки АТФ, нарушению буферизации кальция и генерации активных форм кислорода. Такие нарушения приводят к нейродегенеративным изменениям и развитию болезни Гентингтона, биполярного и депрессивного расстройств, шизофрении [19—22].
Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) играет важную роль в регуляции процессов нейрогенеза, формирования клеток определенной медиаторной специфичности, модификации нейронных сетей с образованием новых синапсов и перестройки синаптической передачи. В ряде исследований однонуклеотидные замены в гене BDNF, включая наиболее изученную rs6265, в разных популяциях были ассоциированы с аутизмом, депрессивным расстройством, болезнью Альцгеймера и др. [23].
Цель исследования — оценка частоты встречаемости 11 однонуклеотидных замен, расположенных в генах, кодирующих рецепторы серотонина (HTR2A), CNTF, UCP2, MTHFR, MTR, MTRR, дипептидилкарбоксипептидазу 1 (ACE), γ-коактиватор рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (PPARGC1A), и BDNF в случайной выборке, и сравнение распределения минорных аллелей с данными популяционных исследований.
Материал и методы
В работе были протестированы 128 неродственных испытуемых мужского и женского пола, в возрасте от 18 до 54 лет, представляющих популяцию русских, проживающих на территории Северо-Западного, Южного и Северо-Кавказского федеральных округов.
Для проведения анализа использовали свежую цельную кровь, взятую из кубитальной вены испытуемых в объеме 10 мл в вакуумные пробирки, содержащие 0,5М раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Образцы были подвергнуты процедуре селективного лизиса эритроцитов с помощью раствора гемолитика («ЦНИИЭ Роспотребнадзора», Россия). Выделение геномной ДНК из взвеси лейкоцитов проводили методом высаливания и концентрирования на спинн-колонках набором реагентов ExtractDNA Blood («Евроген», Россия), согласно инструкциям производителя. Качественный и количественный анализ полученных образцов ДНК проводили спектрофотометрическим методом на приборе NanoPhotometer NP80 («Implen», Германия).
Генотипирование образцов осуществляли методом Real-time полимеразной цепной реакции (ПЦР) в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя коммерческих наборов реагентов («Синтол» и «Литех», Россия) на детектирующих амплификаторах ДТ-Лайт («ДНК-технологии», Россия) и CFX96 Touch («Bio-Rad», США).
Исследование вариабельного участка гена BDNF rs6265 (Val66Met) было проведено с помощью метода ПЦР с анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов.
Выбор прямого и обратного праймеров проводили вручную, используя комбинацию данных из источников литературы и специализированных web-приложений. Синтез праймеров был выполнен ООО «Евроген» (Россия). Температуру отжига для пары праймеров подбирали опытным путем, учитывая расчетную. Для ферментативного гидролиза полиморфного участка G>A rs6265 использовали эндонуклеазу рестрикции PspCI («СибЭнзим», Россия). После обработки данной рестриктазой ПЦР-продукта, содержащего полиморфный локус G/G, фрагмент ДНК общей длиной 316 п.н. разделится на два — 217 и 99 п.н. В случае обнаружения генотипа G/A в смеси будут присутствовать три фрагмента длиной 316, 217 и 99 п.н. В случае присутствия в исследуемом образце генотипа A/A длина фрагмента 326 п.н. останется неизменной.
Полученные в результате амплификации с последующей очисткой двухцепочечной ДНК из реакционной смеси и ферментативным гидролизом фрагменты анализировались методом микрочипового электрофореза с использованием системы MultiNA («Shimadzu», Япония).
Отклонения от равновесия Харди—Вайнберга проверяли с помощью критерия согласия χ2. Различия в частотах аллелей и генотипов исследуемых полиморфизмов между нашими испытуемыми и популяционными выборками анализировали с использованием z-критерия Фишера (уровень значимости 95%).
Все субъекты дали информированное согласие на участие в исследовании. Все методы были выполнены в соответствии с Хельсинкской декларацией, опубликованной Национальным институтом здравоохранения [24].
Исследование одобрено на заседании независимого этического комитета при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова 18 февраля 2020 г. (протокол №232).
Результаты и обсуждение
Аллельные и генотипические частоты rs7997012 (HTR2A), rs6313 (HTR2A), rs1800169 (CNTF), rs660339 (UCP2), rs18011131 (MTHFR), rs1801133 (MTHFR), rs1805087 (MTR), rs1801394 (MTRR), rs4646994 (ACE), rs8192678 (PPARGC1A), rs6265 (BDNF) испытуемых представлены в табл. 1.
Таблица 1. Распределение аллелей и генотипов полиморфизмов в исследуемой выборке
| Ген/полиморфизм | Аллель/генотип | He, абсолютное значение (доля) | Ho, абсолютное значение (доля) | p | χ2 |
| HTR2A rs7997012 A>G | AA | 25 (0,278) | 24 (0,267) | 0,6807 | 0,1694 |
| AG | 43 (0,478) | 45 (0,499) | |||
| GG | 22 (0,244) | 21 (0,234) | |||
| HTR2A rs6313 C>T | CC | 43 (0,478) | 43 (0,478) | 0,8870 | 0,0202 |
| CT | 38 (0,422) | 38 (0,422) | |||
| TT | 9 (0,100) | 9 (0,100) | |||
| CNTF rs1800169 G>A | GG | 60 (0,667) | 59 (0,658) | 0,5873 | 0,2946 |
| GA | 26 (0,289) | 28 (0,306) | |||
| AA | 4 (0,044) | 3 (0,036) | |||
| UCP2 rs660339 C>T | CC | 19 (0,211) | 21 (0,228) | 0,5141 | 0,4257 |
| CT | 48 (0,533) | 45 (0,499) | |||
| TT | 23 (0,256) | 24 (0,273) | |||
| MTHFR rs18011131 A>C | AA | 39 (0,433) | 39 (0,437) | 0,8743 | 0,0250 |
| AC | 41 (0,456) | 40 (0,448) | |||
| CC | 10 (0,111) | 11 (0,115) | |||
| MTHFR rs1801133 C>T | CC | 52 (0,578) | 48 (0,530) | 0,0212 | 5,3088 |
| CT | 27 (0,300) | 35 (0,396) | |||
| TT | 11 (0,122) | 7 (0,074) | |||
| MTR rs1805087 A>G | AA | 52 (0,578) | 51 (0,571) | 0,7225 | 0,1261 |
| AG | 32 (0,355) | 34 (0,369) | |||
| GG | 6 (0,067) | 5 (0,060) | |||
| MTRR rs1801394 A>G | AA | 16 (0,178) | 16 (0,183) | 0,8398 | 0,0409 |
| AG | 45 (0,500) | 44 (0,490) | |||
| GG | 29 (0,322) | 30 (0,327) | |||
| ACE rs4646994 InsDel | InsIns | 30 (0,333) | 28 (0,315) | 0,4763 | 0,5072 |
| InsDel | 41 (0,456) | 45 (0,492) | |||
| DelDel | 19 (0,211) | 17 (0,193) | |||
| PPARGC1A rs8192678 G>A | GG | 43 (0,478) | 40 (0,444) | 0,1547 | 2,0250 |
| GA | 34 (0,378) | 40 (0,444) | |||
| AA | 13 (0,144) | 10 (0,112) | |||
| BDNF rs6265 G>A | GG | 28 (0,737) | 28 (0,732) | 0,7893 | 0,0714 |
| GA | 9 (0,237) | 9 (0,248) | |||
| AA | 1 (0,026) | 1 (0,21) |
Распределение генотипов полиморфизмов rs7997012 и rs6313 HTR2A, rs1800169 CNTF, rs660339 UCP2, rs18011131 MTHFR, rs1805087 MTR, rs1801394 MTRR, rs4646994 ACE, rs8192678 PPARGC1A, rs6265 BDNF соответствовало равновесию Харди—Вайнберга (p>0,05), за исключением rs1801133 MTHFR, в котором наблюдалось уменьшение гетерозиготности (p<0,05), что указывает на необходимость увеличения размера выборки. Доля минорных аллелей исследованных SNP варьировала от 0,145 до 0,572.
Частоты минорных аллелей исследуемых полиморфизмов группы испытуемых сравнили с ранее проведенными исследованиями в европейской, азиатской, африканской и латиноамериканской популяциях (табл. 2) [25].
Таблица 2. Сравнение частоты встречаемости минорных аллелей в исследуемой выборке с распределением в разных расах
| Ген/полиморфизм | Минорный аллель | Частота встречаемости | ||||
| настоящее исследование | европейцы | азиаты | африканцы | латиноамериканцы | ||
| HTR2A rs7997012 | G | 0,483 | 0,573 | 0,755* | 0,928* | 0,756* |
| HTR2A rs6313 | T | 0,311 | 0,420 | 0,551* | 0,385 | 0,424 |
| CNTF rs1800169 | A | 0,189 | 0,145 | 0,132 | 0,055* | 0,115 |
| UCP2 rs660339 | T | 0,522 | 0,403 | 0,445 | 0,445 | 0,437 |
| MTHFR rs18011131 | C | 0,339 | 0,313 | 0,247 | 0,169* | 0,219 |
| MTHFR rs1801133 | T | 0,272 | 0,349 | 0,338 | 0,121* | 0,290 |
| MTR rs1805087 | G | 0,244 | 0,189 | 0,120* | 0,266 | 0,199 |
| MTRR rs1801394 | G | 0,572 | 0,543 | 0,269* | 0,291* | 0,384* |
| ACE rs4646994 | Del | 0,439 | 0,542 | 0,352 | 0,585* | 0,465 |
| PPARGC1A rs8192678 | A | 0,333 | 0,343 | 0,437 | 0,104* | 0,256 |
| BDNF rs6265 | A | 0,145 | 0,194 | 0,445* | 0,043* | 0,148 |
Примечание. * — статистически значимые различия для популяционной выборки.
Полученные данные исследованных полиморфизмов гена, кодирующего рецепторы серотонина, находятся в пределах вариации минорных аллелей, опубликованных и представленных в базах данных для европеоидной популяции, в частности у полиморфизма rs6313 распределение мутантного аллеля совпадает с африканской и латиноамериканской популяциями. У полиморфизма rs1800169 (CNTF) частота вариации минорного аллеля коррелирует с данными европейской, азиатской и латиноамериканской популяций, что наблюдается и в исследуемых полиморфизмах rs1801131 и rs1801133 гена, кодирующего MTHFR, rs14646994 гена дипептидилкарбоксипептидазы 1 (ACE), а также rs8192678 гена белка PPARGC1A. Проведенный анализ исследуемого генетического маркера гена, кодирующего UCP2, не показал существенных отличий с приведенными популяциями. Между тем достоверное отклонение распределения минорного аллеля исследуемой группы существенно отличается при сравнении только азиатской популяции полиморфизма гена MTR. При анализе полиморфизма rs1801394 гена, кодирующего MTRR, достоверных отклонений не наблюдалось только при сравнении с европейской популяцией. У полиморфизма rs6265 (BDNF) частота встречаемости минорного аллеля коррелирует с распределением в европейской и латиноамериканской популяциях.
На основании полученных данных следует предположить, что у носителей минорных аллелей исследованных полиморфизмов повышается риск нарушения синтеза нейромедиаторов, уменьшение активности дофамин β-гидроксилазы, синтеза серотонина и увеличение активности холинацетилтрансферазы, снижение активности кодируемых ферментов, обеспечивающих превращение гомоцистеина в метионин [26, 27]. На фоне таких изменений увеличивается риск развития когнитивных расстройств, протектирование суицидального поведения, нестабильности в адаптации к психоэмоциональным расстройствам, скачки в изменении настроения, а также парадоксальных реакций на стресс [28—30].
Заключение
Полученные результаты позволяют судить о распределении минорных аллелей исследованных полиморфизмов в нашей выборке. Статистически значимые согласованности частот аллелей в исследуемой группе с популяциями из других регионов и проведенными в них исследованиями являются основанием для включения выбранных ОНП в перечень ограниченного набора молекулярно-генетических маркеров, позволяющего дополнить систему мониторинга психического здоровья и совершенствования профессиональной подготовки лиц экстремальных профессий. Данные по частотам встречаемости аллелей генов-кандидатов могут быть использованы для проведения дальнейших исследований.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.