Применение оценки уровня сывороточных легких цепей нейрофиламентов в диагностике, мониторинге лечения и прогнозе при рассеянном склерозе

В последние годы значительно выросла потребность в получении объективных стандартов диагностики заболеваний, что связано не только с желанием пациента или лечащего врача знать точный патогенез протекающих нарушений, но и необходимостью выбора терапии, при которой соотношение риска и пользы должно оцениваться индивидуально в каждом рассматриваемом случае. К числу таких заболеваний относится рассеянный склероз (РС) — воспалительное заболевание ЦНС, характеризующееся гетерогенными симптомами вследствие множественного поражения двигательной, сенсорной, зрительной и вегетативной систем [1].

В связи с большим количеством заболеваний, имеющих сходную с РС клиническую картину и идентичные признаки магнитно-резонансной визуализации, актуальным становится поиск биомаркеров, способных верифицировать диагноз Р.С. Кроме того, очень важна способность лабораторных показателей предсказывать течение заболевания, иметь прогностическую ценность для подбора терапии, заблаговременного предвидения обострений, а также перспектив ведения социально активной жизни пациента в целом.

Нейродегенерация является одним из доказанных процессов, протекающих при РС, однако степень ее выраженности неоднородна в разных клинических случаях, и к настоящему моменту, несмотря на значительную роль в формирующейся инвалидизации, нет достоверного метода ее количественного подсчета. Одним из биомаркеров, на которые возлагают большие надежды в вопросах оценки течения заболевания и последующего развития нейродегенерации при РС, являются легкие цепи нейрофиламентов (НФЛ), которые стало возможно выявлять в сыворотке крови [2].

Нейрофиламенты (НФ) принадлежат к семейству белков промежуточных филаментов и являются основными компонентами цитоскелета аксонов [3]. НФ относятся к средним филаментам в соответствии с их диаметром (около 10 нм), который составляет для нитей актина около 6 нм и для нитей миозина около 15 нм. НФ можно разделить по молекулярной массе на легкие цепи НФ (НФЛ) — 68 кДа; средние цепи НФ (НФМ) — 160 кДа; тяжелые цепи НФ (НФТ) — 205 кДа [4—5]. Точные функции НФ остаются неизвестными, тем не менее считается, что они имеют решающее значение для радиального роста и стабильности аксонов, поскольку обеспечивают эффективную высокоскоростную нервную проводимость [6, 7]. В работе A. Yuan и соавт. [8] показано, что НФ взаимодействуют с другими белками и органеллами, включая митохондрии и микротрубочки. Предполагается, что они выполняют важные функции помимо сохранения стабильности аксонов [4]. Некоторые мутации, идентифицированные в генах, которые кодируют нейрофиламентные белки, могут привести к аномальной агрегации и накоплению НФ с последующей дисфункцией аксонов и развивающейся нейродегенерацией. Например, мутации в гене NEFL, который кодирует НФЛ, обусловливают развитие болезни Шарко—Мари—Тута (ШМТ) типа 2E (ШMT2E) или типа 1 °F (ШMT1F). Мутации генов, которые кодируют периферин (ген PRPH), НФТ и НФМ, имеют повышенную встречаемость при боковом амиотрофическом склерозе (БАС) и семейном варианте болезни Паркинсона (БП) [4]. Мутации в генах, которые не кодируют нейрофиламентные белки, могут оказывать вторичное влияние на агрегацию НФ: например, мутации в кодировке информации о белке теплового шока 27 кДа — белка 1 при ШМТ2 °F; гигаксонина при гигантской аксональной нейропатии и супероксиддисмутазы 1 (SOD1) при БАС [8, 9].

Исследование, проведенное R. Beck и соавт. [10], продемонстрировало, что при нормальных условиях НФ находятся в аксонах в очень стабильном состоянии и их текучесть крайне низка, однако при таких заболеваниях, как БАС, деменция с тельцами Леви или БП, нити образуют жидкокристаллическую сеть геля, и накопление НФ вне нейронов происходит в связи со стехиометрией субъединиц и степенью их фосфорилирования.

Таким образом, в норме НФ находятся внутри нейронов, однако из-за повреждения аксонов ЦНС или периферической нервной системы они могут появляться в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) и крови [11, 12]. Имеются исследования, в которых было выявлено повышение уровня НФ в ЦСЖ при РС для НФТ и НФЛ (для НФМ оно практически не изучалось) [13]. Однако учитывая, что для забора ЦСЖ требуется проведение люмбальной пункции, являющейся инвазивной процедурой, подобные исследования были нечастыми и не проводились систематически. По тем же причинам НФ редко измерялись при заболеваниях, при которых люмбальная пункция осуществляется не во всех случаях или редко [4]. В настоящее время ситуация изменилась в положительном направлении и исследования стали проводиться чаще, кроме того, помимо ЦСЖ стала изучаться сыворотка крови. В большинстве работ очевидным положительным аспектом исследования НФЛ является возможность анализа сыворотки крови, что по методике забора относится к процедурам с меньшим соотношением риск—польза, чем люмбальная пункция [14].

J. Kuhle и соавт. [15] было установлено, что оценка НФЛ в сравнении с НФТ обладает большей чувствительностью при диагностике РС и клинически-изолированного синдрома (КИС) по отношению к группе контроля.

Прежде считалось, что РС является исключительно воспалительным заболеванием ЦНС, однако в настоящее время имеются подтвержденные данные, свидетельствующие о том, что патологические процессы сложны и многообразны и включают в себя как аксональное повреждение, так и нейродегенерацию [16]. По другим источникам, ключевым звеном нейродегенерации является нейроаксональное повреждение, влекущее за собой нейродегенерацию, в последующем занимающую одну из главных ролей в развитии постоянной инвалидизации при РС [17]. Накопленные сведения показывают, что повреждение аксонов и нейродегенерация появляются уже на ранних стадиях РС [18].

В нескольких работах [19—22] было описано, что уровни НФЛ в ЦСЖ имеют корреляцию с возникновением поражений, выявленных при МРТ, обострениями РС, неврологическими нарушениями и эффективностью терапии при РС.

Данные крупного метаанализа, проведенного L. Cai и J. Huang [23], который включал 10 наиболее качественных исследований с общим участием 469 пациентов с РС и 326 здоровых, продемонстрировали, что у пациентов с РС уровень НФЛ в ЦСЖ был значительно выше по сравнению с контрольными группами. Для определения НФЛ использовался иммуноферментный анализ (ИФА) ELISA (Enzyme-linked immunosorbent. assay). По данным этого же метаанализа, в которых учитывались результаты 4 исследований (1196 пациентов с РС и 660 здоровых), было выявлено, что уровень НФЛ в сыворотке крови был значительно выше у пациентов с РС, чем в контрольных группах. В 3 исследованиях применялись иммунологические анализаторы на основе электрохемилюминесценции (ЭХЛ) ECL (electrochemiluminescence), в 1 — система ELISA. Результаты метаанализа подтвердили на крупных выборках сопоставимость корреляции в крови и ЦСЖ уровня НФЛ при структурном повреждении нервной ткани.

C. Malmestrom и соавт. и L. Novakova и соавт. обнаружили, что уровни НФЛ повышаются на всех стадиях РС, особенно при ремиттирующем и при прогрессирующем типах течения, а во время приема препаратов, изменяющих течение РС (ПИТРС), снижаются в сторону нормального состояния. Эти факты являются свидетельством связи НФЛ с различными патологическими процессами, протекающими при РС, отражающими активность, прогрессирование заболевания и эффективность оказываемого лечения [22, 24—30].

Результаты большого проспективного исследования C. Barro и соавт. [31] с участием пациентов с ремиттирующим и прогрессирующим течением РС показали, что высокие концентрации НФЛ на начальной стадии заболевания связаны с более быстрым развитием инвалидизирующих осложнений и в последующем предсказывают нарастающую атрофию головного и спинного мозга. Известно, что НФЛ отражают одновременные изменения как в структуре нейронов, так и в чувствительности к проводимому лечению, что повышает вероятность внедрения стандартизированного, надежного и широкодоступного анализа с референтными значениями нормы сывороточных НФЛ (сНФЛ) [2, 26].

G. Disanto и соавт. [32] выявили, что уровни сНФЛ могут быть точно измерены у пациентов с РС с применением современных методов детекции. Кроме того, авторы указали, что сНФЛ сопоставимо отражают уровни НФЛ в ЦСЖ и положительно связаны с поражениями, выявленными при МРТ. Было продемонстрировано, что сНФЛ увеличиваются после клинических обострений и уменьшаются после начала приема ПИТРС. Примечательно, что положительные клинические эффекты лечения уже были исследованы [20, 22, 26, 33—35] в связи со снижением уровня НФЛ в ЦСЖ у пациентов, получающих финголимод, натализумаб и ритуксимаб, однако для оценки сывороточных показателей НФЛ необходимо проведение дополнительных исследований.

Также G. Disanto и соавт. [32] обнаружили корреляцию риска обострений в ближайшем времени и инвалидности, определяемых по расширенной шкале оценки инвалидизации (Expanded Disability Status Scale — EDSS), с повышением уровня сНФЛ. Это свидетельствует о том, что уровни сНФЛ связаны как с острым воспалительным, так и с хроническим диффузным повреждением нейронов, приводящим к прогрессированию инвалидизации. Интересно, что корреляция значений по EDSS с сНФЛ оказалась статистически сильнее у пациентов с КИС и ремиттирующим течением РС, чем у больных с первично- или вторично-прогрессирующим течением, что, возможно, связано с постепенной инвалидизацией, характерной для прогрессирования РС.

S. Mariotto и соавт. [36] показали, что концентрация сНФЛ повышена у пациентов с выявленными миелин-олигодендроцитарными гликопротеинами (по своей структуре являющимися иммуноглобулинами) и, что особенно важно, с антителами к аквапорину-4, ассоциированными с оптиконейромиелитом. Авторы еще раз подчеркнули возможность оценки заболеваний, сопровождающихся аксональным повреждением.

Тем не менее сНФЛ требует более детального исследования для определения границ его прогностических возможностей. Так, в одной из работ [37] было выявлено, что повышенный уровень сНФЛ не был связан с ускоренным переходом КИС в РС с подтвержденной нейровизуализационной картиной, хотя эта теория на предыдущих этапах исследований обсуждалась.

С момента открытия и начала исследования НФЛ измерения производились как в ЦСЖ, так и в периферической крови. На начальных этапах исследование осуществлялось с применением иммуноанализаторов первого поколения, которые в лучшем случае были полуколичественными. Очевидным следующим шагом стали иммуноблоты, основанные на электрофоретическом разделении белков, или дот-блоттинге, — они достоверно определяли наличие изоформ НФ в ЦСЖ и сыворотке крови пациентов с целым рядом заболеваний [38].

Технология «сэндвич» ELISA, относящаяся ко второму поколению, дала возможность получить первые точные количественные данные, которые позволили оценить прогностическую и диагностическую ценность НФТ и НФЛ в ЦСЖ при различных заболеваниях [39—42]. Жидкие среды, которые анализировались с помощью этой методики, включили в себя интерстициальную, внеклеточную, амниотическую жидкости, сыворотку, плазму и стекловидное тело [43, 44]. Авторы метаанализов и международных исследований высокого уровня показали, что в экспертных лабораториях может быть достигнута высокая точность измерений, тем не менее они также подчеркивали необходимость улучшения стандартизации технологии [45, 46].

Технология ECL (третье поколение) позволила существенно улучшить аналитическую чувствительность. К настоящему моменту уже известно, что ECL имеет высокую чувствительность, широкий динамический диапазон и требует небольшого объема жидкости для исследования [47—51].

Технология четвертого поколения — SiMoA (single-moleculearray) — повысила аналитическую чувствительность до такой степени, что надежная количественная оценка уровней сНФЛ стала возможной во всем диапазоне концентраций, которые наблюдаются в физиологических условиях и при заболеваниях [32, 52—54]. Этот передовой метод основан на одномолекулярных матрицах и одновременном подсчете отдельных микроскопических шариков захвата (диаметром 2,7 мкм), которые несут сэндвичевые комплексы антител (2 антитела и 1 антиген) [4].

Оценка сНФЛ представляет собой огромную возможность для мониторинга активности и прогрессирования заболевания. Биомаркер крови имеет внутренние характеристики, такие как отражение состояния всей ЦНС в режиме реального времени, низкую стоимость и возможность повторных измерений. Последний пункт также имеет фундаментальное значение для применения сНФЛ в качестве конечной точки в клинических испытаниях или обычной клинической практике. Тесная связь с клиническими обострениями, корреляция с уровнем инвалидизации, показателями воспаления при МРТ и повреждением тканей, как головного, так и спинного мозга, представляют собой дополнительные преимущества сНФЛ как биомаркера периферической крови при РС [17].

Таким образом, система ELISA (Uman Diagnostics), обладающая высокой коммерческой доступностью, может использоваться для измерения НФЛ в ЦСЖ, но не рекомендуется для проведения измерений крови [32]. Осуществление анализа на основе ECL позволяет обнаружить увеличение концентрации сНФЛ у пациентов как с КИС, так и с уже развившимся РС [19, 37, 55—56]. Однако эти исследования ограничены все еще относительно низкой чувствительностью [53]. Анализ НФЛ на основании технологии Simoa показал в 126 и 25 раз более высокую чувствительность, чем ELISA и ECL соответственно. Технология Simoa позволяет измерить сНФЛ до нескольких пг/мл [53, 57]. Совершенствование методов детекции биомаркеров в сыворотке крови открывает новые возможности для диагностики РС, динамического контроля течения заболевания, а также эффекта проводимой терапии.

Для того чтобы оценить наличие новых очагов поражения ЦНС, необходимо применять метод нейровизуализации (МРТ), к настоящему моменту являющийся единственным исследованием маркеров активности заболевания с высоким уровнем достоверности и повседневно использующийся в клинической практике [4]. Тем не менее МРТ в первую очередь выявляет повреждения в белом веществе, а повреждение серого вещества стандартными методами визуализации в значительной степени не учитывается [58]. Несколько объемных измерений на основе МРТ, включая анализ толщины коры головного мозга, были использованы для оценки дегенерации нейронов, однако специфичность и чувствительность этих мер для отдельных пациентов оказались ограничены [59].

Крупное проспективное исследование, в которое были включены 1417 пациентов с РС, проведенное сообществом МРТ при РС (MAGNIMS — Magnetic Resonance Imaging in MS) [60], показало, что последовательность, в которой области серого вещества становились атрофичными на МРТ-изображениях, имела специфические особенности в зависимости от типа течения РС, а при развитии заболевания атрофия распространялась, охватывая больше областей коры головного мозга.

G. Giovannoni [17] в своей работе описал, что уровень сНФЛ увеличивался при наличии процесса активного воспаления, определенного методом измерения количества очагов, копящих контраст, а также новых или увеличивающихся очагов на T2-изображении. Кроме того, число очагов на T2 коррелировало с сНФЛ. Следовательно, объем всех очагов на T2 становился более чувствительным показателем поражения головного мозга при его оценке в совокупности с сНФЛ. В итоге автор отметил, что сНФЛ может представлять собой более точный показатель продолжающегося нейроаксонального поражения и лучшего предиктора атрофии головного мозга, чем только оценка активных и некопящих контраст очагов по данным МРТ головного мозга. По данным другого исследования [56], НФЛ в ЦСЖ и сыворотке крови при ремиттирующем течении РС были сопоставимы, при этом уровни сНФЛ коррелировали с данными МРТ по тяжести заболевания.

В двухлетнем исследовании, проведенном K. Varhaug и соавт. [61], которое включало пациентов с ремиттирующим течением РС, было выявлено, что увеличение уровня сНФЛ на 10 пг/мл давало повышенный риск образования новых очагов, копящих контраст, определяемых при T1 и T2, в ближайшем времени.

НФЛ — это составная часть нейронального цитоскелета, являющаяся маркером нейроаксонального повреждения при многих нейродегенеративных заболеваниях [2]. НФЛ играют важную роль в росте аксонов, стабильности и внутриклеточном транспорте [62].

На основании накопленного научного опыта можно сделать вывод, что НФЛ являются биомаркером нарушения структурной организации аксонов и отражают формирующуюся нейродегенерацию, однако из-за их встречаемости, помимо РС, при инсульте, БАС, лобно-височной деменции, спинальной травме, паранеопластических процессах ЦНС, расстройствах периферической нервной системы НФЛ не могут считаться биомаркером, подтверждающим диагноз РС [24, 63—70]. Тем не менее значимость сНФЛ для определения эффективности проводимого лечения ПИТРС, прогнозирования развития в ближайшем времени обострений и быстрого нарастания инвалидизации на начальных этапах течения РС является высокой. Кроме того, клинические исследования и их результаты подтверждают, что у пациентов с более высоким уровнем сНФЛ в дебюте заболевания впоследствии наблюдались более тяжелые ранние клинические исходы заболевания и выраженная атрофия ЦНС в целом [31—32].

Учеными выдвинута идея контроля сНФЛ с временным интервалом около 3—6 мес в зависимости от течения РС для динамической оценки состояния пациента, что позволит избежать рутинного проведения МРТ головного мозга с контрастированием [71]. Это становится возможным в связи с тем, что при развитии очагов, копящих контраст, на T1-взвешенном изображении отражаются участки повышенной проницаемости или нарушения гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). В свою очередь повышенная проницаемость ГЭБ приводит к попаданию большего количества НФЛ в кровяное русло, тем самым открывая возможность к периферической детекции биомаркера поражения ЦНС — НФЛ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Алифирова В.М. — https://orcid.org/0000-0002-4140-3223; e-mail: v_alifirova@mail.ru

Каменских Е.М. — https://orcid.org/0000-0003-0814-8344; e-mail: em_kamenskih@mail.ru

Королева Е.С. — https://orcid.org/0000-0003-1911-166X; e-mail: kattorina@list.ru

Как цитировать:

Алифирова В.М., Каменских Е.М., Королева Е.С. Применение оценки уровня сывороточных легких цепей нейрофиламентов в диагностике, мониторинге лечения и прогнозе при рассеянном склерозе. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2019;119(10, вып. 2):7-13. https://doi.org/10.17116/jnevro20191191027

Автор, ответственный за переписку: Каменских Екатерина Михайловна — e-mail: em_kamenskih@mail.ru