Возможность диагностики воспалительной реакции при ишемическом инсульте

Ишемический инсульт (ИИ) — одно из наиболее тяжелых заболеваний, развитие которого связано с высокой летальностью и инвалидизацией. ИИ характеризуется высоким риском развития воспалительных осложнений, наиболее частыми среди которых являются бронхолегочные заболевания, воспалительные заболевания мочевыделительной системы и др. [1]. Наличие в организме больного с ИИ внецеребрального очага воспаления значительно осложняет течение заболевания. Риск развития воспалительных осложнений повышен у пожилых больных, пациентов с избыточной массой тела, сопутствующими соматическими заболеваниями, в частности сахарным диабетом [2]. Показано [3], что развитие у больного с ИИ пневмонии, бронхопневмонии, бронхита связано с повышением риска наступления летального исхода, более тяжелой инвалидизации. С другой стороны, установлено, что наличие воспалительного процесса в организме, очага инфекции различной локализации, а также бактериемии является самостоятельным фактором риска тромботических осложнений, в частности инфаркта миокарда [4] и ИИ [5]. В связи с этим вполне очевидно, что своевременное выявление воспалительного процесса и начало лечения помогут избежать многих тяжелых последствий.

Надо иметь в виду, что в настоящее время существуют высокоэффективные средства диагностики структурных поражений головного мозга (КТ, МРТ), однако раннее выявление воспалительного процесса в ткани головного мозга затруднительно.

Сам по себе ИИ, как правило, вызывает значимые иммунологические сдвиги в организме. Развитие иммунной реакции обусловлено резорбцией области ишемического некроза мозгового вещества, повышением проницаемости гематоэнцефалического барьера, реализацией стресса в ответ на ИИ [6, 7]. Разграничить проявления воспалительной реакции в ответ на развитие инфекционного процесса в организме больного с ИИ и реакции в ответ на первичное повреждение головного мозга достаточно сложно, в связи с чем существует необходимость поиска маркеров раннего воспалительного ответа у пациентов с острым ИИ.

Для ответа на вопрос, в какой степени ИИ способен привести к активации иммунной системы и инициации воспалительного процесса, следует определиться с однозначным надежным критерием воспаления. Таким критерием является активация лейкоцитов. Известно, что активированные нейтрофилы, макрофаги продуцируют супероксидный анион-радикал благодаря активации фермента НАДФН-оксидазы [8]. В работах А.Ф. Ванина и соавт. [9, 10] показано, что оксид азота (NO), а также соединения-доноры NO являются высокоэффективными ловушками супероксида. Взаимодействие супероксида с донорами NO приводит к образованию нитрита (NO₂^–) и нетиолатных нитрозосоединений (RNNO), в норме содержащихся в тканях в следовых количествах. Необходимо отметить, что соединения-доноры NO присутствуют практически во всех тканях организма [11]. Следовательно, если есть возможность оперативно контролировать содержание этих соединений, то можно контролировать факт продукции супероксида, а значит, и активации лейкоцитов.

Цель исследования — изучение диагностических возможностей определения содержания NO₂^– и RNNO (NO₂^–+RNNO) в плазме крови и в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) больных с острым ИИ.

Обследовали 24 больных с острым каротидным ИИ (13 мужчин и 11 женщин, средний возраст 56,9±12,8 года), госпитализированных в течение первых суток от момента развития заболевания. Диагноз И.И., локализация и объем поражения устанавливались на основании клинической картины и подтверждались результатами КТ или МРТ головного мозга.

Критерии включения в исследование: острый ИИ, давность ИИ не более 24 ч. Критерии исключения: геморрагический или смешанный характер ИИ; локализация очага в вертебрально-базилярной системе; срок более 24 ч с момента развития ИИ; онкологические заболевания, лейкозы, ВИЧ.

Для уточнения диагноза и исключения геморрагического характера инсульта и воспалительного поражения головного мозга и его оболочек проводилась люмбальная пункция с исследованием ЦСЖ. Люмбальная пункция проводилась после исключения дислокации головного мозга методами нейровизуализации в положении больного лежа на боку.

Забор крови осуществляли у всех больных при поступлении в количестве 5 мл. Для предотвращения свертывания крови использовали гепарин 0,1 мл 1% раствора на 10 мл крови. Плазму получали путем центрифугирования образцов на центрифуге ЦУМ-1 при 3000 об/мин в течение 10 мин [12]. Содержание продуктов окисления NO определяли в плазме крови и ЦСЖ с помощью ферментного сенсора, основанного на уникальном свойстве NO₂^–, RNNO, S-нитрозотиолов (RSNO), динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) ингибировать фермент каталазу в присутствии галоид-ионов и утрачивать это свойство под действием определенных химических агентов, различных для каждой группы соединений. Так, содержащиеся в норме в плазме крови ДНКЖ разрушаются хелаторами железа (ЭДТА), а высвобождающийся из них NO перехватывается оксигемоглобином, в связи с чем ингибирующий эффект утрачивается. RSNO трансформируются в ДНКЖ под воздействием закисного железа и приобретают их свойства. NO₂^– и RNNO сохраняют ингибирующую способность в среде, содержащей хелатор железа и ловушку NO. Других эффективных ингибиторов каталазы плазма не содержит. Нитрат восстанавливается треххлористым ванадием до нитрита и приобретает соответствующие ингибирующие свойства [13, 14]. Данный метод позволяет количественно определить весь спектр продуктов окисления NO без предварительной подготовки и очистки образца с чувствительностью до 50 нМ. Для определения активности каталазы использовалась установка, созданная на основе прибора Dithermanal («Vaskut-EMG», Венгрия). Активность измерялась по кинетике теплопродукции, сопровождающей каталазный процесс [12, 13]. Выраженность неврологического дефицита оценивали по шкале NIHSS на момент госпитализации и при выписке из стационара. В зависимости от результатов МРТ выделяли группы пациентов с малым (лакунарный), средним и крупным ИИ.

Для оценки связи между размерами очага ИИ и концентрацией NO₂^–+RNNO в ЦСЖ были сформированы две группы: 1-я — 10 больных с территориальным ИИ и 2-я — 10 пациентов с малым ИИ.

В контрольную группу были включены 5 больных, клиническое наблюдение которых и результаты повторного нейровизуализационного обследования (МРТ, КТ) не подтвердили диагноз ИИ. У этих больных отсутствовали острые заболевания ЦНС, обследование проводилось по поводу последствий острого нарушения мозгового кровообращения или черепно-мозговой травмы.

Материалы обрабатывали статистически с применением программного пакета SPSS 19.0. С учетом малых размеров выборки использовалась поправка Иейтса. За достоверные принимали различия на уровне р<0,05.

Нитро- и нитрозосоединения в ЦСЖ человека имеют примерно тот же состав, что и в плазме крови: ДНКЖ в концентрации от 4 до 15 мкМ и нитрат в концентрации 40—60 мкМ. Как показано в наших работах, в норме содержание NO₂^- и RNNO в большинстве живых тканей менее 100 нМ [11, 14]. В то же время содержание соединений-доноров NO (RSNO, ДНКЖ, некоторые высокомолекулярные нитраты) может достигать десятков микромоль [11]. Соединения, детектируемые как NO₂^–+RNNO, появляются в плазме крови при воспалении, причем задолго до проявления клинических признаков [14—18]. Как было показано на модельных системах [14, 15, 17], появление NO₂^–+RNNO является результатом трансформации RSNO либо ДНКЖ под воздействием активных форм кислорода, продуцируемых активированными лейкоцитами.

Как следует из данных, представленных в таблице, у всех больных с верифицированным ИИ ЦСЖ содержала NO₂^–+RNNO в концентрации от 0,4 до 2,0 мкМ. Имела место связь между размерами очага ИИ и концентрацией NO₂^–+RNNO в ЦСЖ: у больных со средним размером очага ИИ она составила 1,01± 0,13 мкМ, у пациентов с малым размеров ИИ — 0,71±0,07 мкМ (U-критерий Манна—Уитни 16,5; p<0,05). В контрольной группе концентрация NO₂^–+RNNO в ЦСЖ была менее 0,1 мкМ (см. таблицу).

Не выявили зависимости выраженности неврологического дефицита на момент госпитализации и при выписке из стационара от содержания NO₂^–+RNNO в ЦСЖ (r=0,134; p>0,5; r=0,155; p>0,5). Установили связь концентрации NO₂^–+RNNO в ЦСЖ со степенью регресса неврологического дефицита.

Плазма крови большинства поступивших в стационар больных с ИИ содержала NO₂^–+RNNO в концентрации менее 100 нМ, что свидетельствовало об отсутствии активации лейкоцитов в периферической крови. Только у 5 больных концентрация NO₂^–+RNNO в плазме крови была выше 0,1 мкМ. В ряде случаев повышение содержания в крови NO₂^–+RNNO наблюдалось у больных без клинических проявлений острого инфекционного процесса или предшествовало им. Например, у больного А. (48 лет) с малым ИИ и у больной М. (80 лет) при отсутствии клинических проявлений острого воспалительного процесса, нормальных результатах рентгенографии легких имело место значительное увеличение концентрации в крови NO₂^–+RNNO (0,9 и 0,8 мкМ соответственно), которое было ассоциировано с умеренным лейкоцитозом (10,9 и 18,000 тыс./мкл соответственно) со сдвигом формулы вправо (палочкоядерные нейтрофилы — 12 и 8% соответственно при норме 1—6%). В последующем, за время пребывания в клинике, у этих больных развития острого воспалительного заболевания зарегистрировано не было.

У 2 больных увеличение концентрации в крови NO₂^–+RNNO не сопровождалось изменениями клинических и/или лабораторных показателей, которые могли бы свидетельствовать о наличии острого воспалительного заболевания. Вместе с тем у одного из них имела место хроническая почечная недостаточность с наличием почечных конкрементов, у другого — сочетание нарушения толерантности к глюкозе и послеоперационного гипотиреоза, требующего заместительной гормональной терапии. Течение И.И. у обоих пациентов носило благоприятный характер с практически полным регрессом очагового неврологического дефицита.

В целом концентрация в крови NO₂^–+RNNO у больных с ИИ, у которых имелись клинические и/или лабораторные признаки соматического заболевания, составила 0,77±0,24 мкМ, тогда как у пациентов с ИИ, у которых результаты клинико-лабораторного обследования и анамнестические сведения указывали на отсутствие значимых соматических заболеваний, она составила 0,25±0,19 мкМ (p<0,05).

У всех больных контрольной группы концентрация NO₂—+RNNO в плазме крови была менее 0,1 мкМ (см. таблицу). Не было выявлено связи между концентрацией NO₂^–+ RNNO в плазме крови и величиной ИИ (r=0,193; p>0,5).

ИИ повышает риск развития воспалительных заболеваний. В нашем предыдущем исследовании [18] из 29 больных с ИИ, поступивших в стационар, у 9 концентрация NO₂^–+RNNO в плазме крови превышала 0,1 мкМ, у 3 из них были явные клинические признаки воспаления. Через 5 сут у большинства пациентов проявились клинические симптомы, а общее число больных с повышенным содержанием NO₂^–+RNNO достигло 14 (50%), из них 12 имели выраженные клинические симптомы. Однако не наблюдали ни одного случая, когда при выраженных клинических проявлениях было зарегистрировано нормальное содержание NO₂^–+RNNO. Эти закономерности имели место и в других наших исследованиях [12, 16].

Следует также отметить, что повышение концентрации NO₂^–+RNNO в крови отмечено у пациентов с ИИ как с острыми, так и с хроническими соматическими заболеваниями. Указанный факт свидетельствует о высокой чувствительности метода в отношении выявления сопутствующих ИИ соматических заболеваний (повышение концентрации NO₂^–+RNNO зачастую опережает изменения формулы крови и появление в крови белков-маркеров воспаления), однако он требует тщательного анализа клинической картины заболевания с целью выявления конкретной причины активации лейкоцитов.

Появление NO₂^–+RNNO — результат взаимодействия активных форм кислорода, продуцируемых активированными лейкоцитами, с донорами NO (RSNO, ДНКЖ). Продукция NO₂^–+RNNO в крови при активации лейкоцитов зимозаном предотвращается супероксиддисмутазой [17]. Но достаточно 700 активированных лейкоцитов на 1 мкл, чтобы 30—40% всех содержащихся в плазме ДНКЖ (10 мкМ) трансформировались до NO₂^–+RNNO [17]. Следовательно, мы имеем высокочувствительный и очень специфичный показатель активации лейкоцитов.

Из полученных данных следует, что ИИ практически всегда сопровождается активацией клеток, способных продуцировать активные формы кислорода. По крайней мере у всех 24 больных с подтвержденным диагнозом ИИ имело место появление в ЦСЖ NO₂^–+RNNO в концентрации выше 0,1 мкМ. Однако лишь в 5 случаях повышенная концентрация NO₂^–+RNNO фиксировалась не только в ЦСЖ, но и в крови. Какой-либо зависимости между концентрацией NO₂^–+RNNO в ЦСЖ и плазме обнаружено не было, что может быть обусловлено различными источниками ее повышения: как церебральными (вследствие непосредственного поражения мозгового вещества), так и внецеребральными — при наличии острых и хронических заболеваний у больного с И.И. Тем не менее при других воспалительных заболеваниях (острый аппендицит, острый панкреатит, холецистит [12], пневмония, острый бронхит [18], грипп и ОРЗ [12]) плазма крови у больных содержала повышенную концентрацию NO₂^–+RNNO, которая снижалась по мере выздоровления. Причем концентрация NO₂^–+RNNO повышалась до появления клинических признаков воспаления.

Интерес представляет преждевременное излитие околоплодных вод (ПИОВ) у беременных, которое обычно сопровождается хориоамнионитом. Во всех случаях диагностированного ПИОВ наблюдалась повышенная концентрация NO₂^–+RNNO в плазме крови при отсутствии каких-либо клинических симптомов воспаления [16]. В случае ИИ в отличие от ПИОВ повышенная концентрация NO₂^–+RNNO выявляется в большинстве случаев только в ЦСЖ, но не в плазме крови, что может быть связано с малой проницаемостью гематоэнцефалического барьера для NO₂^–+RNNO. Но в любом случае этот факт свидетельствует о том, что воспаление при ИИ ограничивается мозговой тканью и само по себе не носит генерализованного характера. Следовательно, воспалительные заболевания, наблюдаемые у многих больных ИИ, возникают на фоне изменений иммунной системы организма, но не являются процессами, непосредственно индуцированными воспалением, развившимся вследствие первичного поражения тканей мозга. Таким образом, анализ содержания NO₂^–+RNNO в ЦСЖ и в плазме крови позволяет разграничить воспалительную реакцию, непосредственно связанную с поражением мозгового вещества, и сопутствующие воспалительные заболевания, осложняющие течение ИИ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

*e-mail: vtitov43@yandex.ru