Экспрессия семафорина CD100 на лимфоцитах периферической крови пациентов с ремиттирующим течением рассеянного склероза

Рассеянный склероз (РС) - хроническое заболевание нервной системы, характеризующееся вариабельным клиническим течением и не всегда предсказуемым ответом на лечение [3].

Согласно современным представлениям, РС возникает у генетически предрасположенных лиц после того, как они подверглись воздействию окружающей среды, которое стимулирует миелин-специ­фичные Т-лимфоциты, участвующие в деградации миелина. Активированные Т-лимфоциты дифференцируются в CD4-клетки (Т-хелперы), которые в свою очередь выделяют различные цитокины, индуцируя провоспалительный иммунный ответ. CD4⁺, CD8⁺ и CD19⁺-клетки играют основную роль в патогенезе РС. Под действием цитокинов активируются B-клетки и макрофаги, что ведет к усилению воспалительных изменений [4]. На ранних стадиях повреждение может являться следствием Т-кле­точно­обусловленной деструкции миелин-экспрессирующих клеток [5]. Активация миелин-специфичных Т-клеток происходит в результате контакта Т-лимфоцита с антиген-презентирующими клетками (APCs) - дендритными клетками (DСs), макрофагами или В-лимфоцитами. Такая презентация может происходить как в периферических отделах иммунной системы, с последующей миграцией миелин-специфичных клеток в центральную нервную систему (ЦНС), так и непосредственно в ЦНС. Оба механизма предполагают нарушение гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) - с одной стороны, для антигена, а с другой - для клеток иммунной системы, включая не только Т-лимфоциты, но и APCs. Все решающие этапы данного процесса - презентация антигена, антигензависимая дифференцировка Т-лимфоцитов, миграция через ГЭБ - эффективно регулируются факторами семейства семафоринов [10].

Семафорины - большое семейство белков, часть из которых участвует в направлении роста аксонов во время нейронального развития [10]. Семейство семафоринов включает в себя 8 субклассов, выделенных на основании структурных элементов и аминокислотной последовательности. Существуют секретируемые и мембрансвязанные белки. Белки плексины и нейропилины были определены в качестве первичных рецепторов для семафоринов. Роль этих молекул в нервной системе можно рассматривать с 2 позиций: как руководящие молекулы в развитии и регенерировании ЦНС и как иммунные регуляторы. Было показано, что Sema3A экспрессируется в нейронах при болезни Альцгеймера и в нервно-мышечных соединениях при боковом амиотрофическом склерозе. Эти данные предполагают, что семафорины участвуют в патологии неврологических расстройств в качестве ингибиторов и ускорителей нейрональной регенерации.

CD100 (Sema4D), мембран-ассоциированный сема­форин класса IV, является первым семафорином, роль которого была определена в иммунной системе [9]. CD100 выявлен на высоком уровне в лимфоидных и нелимфоидных органах, включая мозг, сердце, почки, селезенку, тимус и лимфатические узлы. Он в высокой степени экспрессируется на покоящихся Т-клетках, но его экспрессия очень мала на покоящихся B-клетках и APCs, таких как DСs. Экспрессия семафорина на этих клетках повышается при их активации. Cлущивание растворимого Sema4D от поверхности иммунных клеток также зависит от клеточной активации [10]. В иммунной системе Sema4D влияет на поведение B-клеток, дендритных клеток и моноцитов.

Имеются указания на участие иммунного семафорина CD100 в патологических иммунных ответах у мышей и людей [6, 11]. Повышенные уровни растворимого Sema4D обнаружены в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) пациентов с воспалительными демиелинизирующими заболеваниями, а также на мембране Т-лимфоцитов и в сыворотке либо иммунизированных, либо аутоиммунных мышей и пациентов с системным склерозом. Уровни растворимого семафорина Sema4D увеличиваются в ЦСЖ у пациентов с HTLV-1-ассоциированной миелопатией (HAM) [10].

В исследованиях на мышах было выявлено, что Sema4D экспрессируется в белом веществе ЦНС олигодендроцитами, особенно в период миелинизации. Доказано наличие Sema4D в миелине [8].

Sema4D может быть вовлечен в патологические состояния, связанные с олигодендроцитами, такими как РС [9]. Показано, что Sema4D вызывает гибель незрелых нейронов и остановку роста олигодендроцитов [6]. Предполагают, что семафорины могут участвовать в подавлении аксональной регенерации [8].

Выявлены 2 основных рецептора для Sema4D - плексин-B1 и CD72. B-клетки от CD72-дефицитных мышей реагируют гиперпролиферативно на разные стимулы. CD72 является негативным регулятором B-клеточного ответа. CD100 выключает негативные сигнальные эффекты CD72, что выражается в усилении активации B-клеток. В противовес этому CD100-дефицитные мыши испытывали по экспериментальным данным сниженный B-клеточный ответ [11].

Sema4D также играет роль в Т-клеточном ответе, активируя DCs. Sema4D, экспрессируемый на Т-лимфоцитах, взаимодействует с его родственным рецептором на DCs для обеспечения активации и созревания дендритных клеток, в результате чего усиливается Т-клеточная активация. В качестве иммунных регуляторов семафорины играют важнейшую роль в миграции APCs, дифференциации Т-хелперных клеток, примировании антиген-специ­фических Т-клеток и модуляции воспаления. Некоторые механизмы имеют отношение к патологическому процессу при РС, например активация реактивных Т-клеток в периферической иммунной системе, их трансмиграция и реактивация в ЦНС, увеличение воспаления в ЦНС [9].

Sema4D, извлеченный из Т-клеток, также привносит вклад в нейровоспаление путем активации микроглиальных клеток через плексин-B1. Клеточно-заимствованный Sema4D вызывает смерть незрелых нервных клеток [6].

Интересные данные были получены при изучении экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ). Известно, что ЭАЭ отражает некоторые из патогенетических, клинических и терапевтических характеристик РС, обеспечивая понимание молекулярных и клеточных основ заболевания. Однако данные, полученные при изучении ЭАЭ, не всегда отражают весь спектр процессов, происходящих при развитии РС у человека. Изучение экспериментальных моделей РС подтверждает доминирующую роль, которую играют энцефалитогенные Т-лимфоциты в патогенетическом процессе. В частности, индукция ЭАЭ у здоровых животных возможна введением сенсибилизированных in vivo и in vitro к антигенам миелина CD4⁺ Т-лимфоцитов [2].

Лишенные CD100 мыши демонстрируют серьезные нарушения развития B-клеток, Т-клеточ­ного примирования и иммунного ответа [8]. Мыши, дефицитные по Sema4D, развивают более легкую форму ЭАЭ. Также показано, что Sema4D-дефицитные мыши устойчивы к развитию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита [7]. Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что Sema4D вовлечен в патогенез ЭАЭ.

Учитывая разнообразные роли семафоринов и предположительные патологические механизмы при РС, иммунные семафорины могут участвовать в любом этапе патогенеза РС.

Цель исследования - оценка уровня экспрессии семафорина CD100 у пациентов с РС в сравнении со здоровыми, а также изучение количества B-лимфоцитов, несущих рецептор CD72.

Экспрессия семафорина CD100 в субпопуляциях CD3⁺4⁺, CD3+8⁺ Т-лимфоцитов в периферической крови исследована у 22 пациентов с РС, находившихся под наблюдением в Пермском краевом центре рассеянного склероза, и 15 здоровых, сопоставимых по возрасту и полу. Оценке подверглась как доля CD4⁺-Т-лимфоцитов-хелперов и CD8⁺-цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), несущих CD100, так и уровень экспрессии CD100 на клетках, определяемый как Middle Florescence Intensity, MFI. Проанализирован также уровень B-лимфоцитов, несущих CD72.

Иммунологическое исследование проводилось в Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН. Клетки были выделены из периферической крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина (1,077 г/см³). Для дальнейшего анализа использовали нефракционированную суспензию лейкоцитов. Анализ осуществлялся методом проточной цитометрии. Экспрессию CD100 в субпопуляциях CD3⁺4⁺- и CD3⁺8⁺- лимфоцитов оценивали с помощью соответствующих моноклональных антител: анти-CD100*PE («BioLegend»), анти-CD3*PE/Cy7 и анти-CD4/CD8* FITC («Beckman Coulter»). Для оценки функции B-лим­фо­цитов в исследовании использованы антитела анти-CD72 FITC («BioLegend»), антиCD19 PE («BioLegend»). Проводился изотипический контроль к CD100 и CD72.

Основную группу обследованных составили пациенты с достоверным диагнозом РС согласно критериям МакДоналда (2010), с ремиттирующим типом течения заболевания, не получавшие терапию препаратами, изменяющими течение рассеянного склероза (ПИТРС) [1]. Забор материала для исследования производился в стадии клинической ремиссии.

Из исследования исключали пациентов с наличием в анамнезе воздействия гормонотерапии в течение 30 дней до взятия образцов периферической крови.

Средний возраст пациентов был 32,5 года (от 27 до 38 лет). В возрасте 20-30 лет было 8 человек, 31-46 лет - 14. Большую часть пациентов - 17 составили женщины, 5 - мужчины. Длительность заболевания к моменту начала обследования составила 3,5 года (от 1,5 до 8 лет). Группу инвалидности имели 7 человек из 22 (3-ю группу - 5, 2-ю группу - 2).

Дебют РС был представлен следующими симп­томами: сенсорные нарушения - у 7 пациентов, ретробульбарный неврит - у 5, вертиго - у 2, пирамидные нарушения - у 1, стволовые симптомы - у 3, мозжечковые нарушения - у 1, многоочаговый дебют был у 3.

У 1 пациента имела место отягощенная наследственность по аутоиммунным заболеваниям.

Среднее число обострений РС было 2,5 (от 2 до 3). Все пациенты, согласно шкале EDSS, являлись «амбулаторными», т.е. были способны пройти более 500 м. Уровень инвалидизации по шкале EDSS варьировал в диапазоне от 1,5 до 3,5 балла, медиана 2,2 (1,5-3). Выявлены положительные корреляции данного показателя с длительностью заболевания (r=0,52, p=0,013), количеством обострений (r=0,59, p=0,003) и количеством очагов демиелинизации по данным магнитно-резонансной томографии (МРТ) (r=0,51, p=0,015).

МРТ головного мозга с введением контрастного вещества была проведена 13 пациентам из 22, при этом у 7 пациентов из 13 была выявлена активность заболевания в виде накопления контраста в очагах демиелинизации (от 1 до 11 очагов).

Гормонотерапия для купирования клинических проявлений экзацербации РС проводилась до взятия образцов крови у 13 пациентов (в том числе дексаметазон - у 9, метипред - у 3, преднизолон - у 1). Большинству пациентов было предложено начать терапию ПИТРС сразу после взятия образцов крови: лечение глатирамера ацетатом - 9 больным, интерфероном-бета - 12 пациентам.

В контрольной группе использовали лимфоциты здоровых (средний возраст 32,5 года).

При статистической обработке применяли непараметрические методы. Сравнение основной и контрольной групп проводили по тесту Колмогорова-Смирнова. Корреляционный анализ выполнен по Спирмену.

Выявлено, что Т-лимфоциты экспрессируют CD100 как у здоровых, так и у пациентов с РС, т.е. большинство Т-клеток несут на мембране эту молекулу. Ожидаемых количественных отличий между двумя исследуемыми группами не обнаружено (табл. 1).

Показатель уровня эскпрессии CD100 на Т-лимфоцитах MFI был выше в различных субпопуляциях клеток у пациентов с РС в сравнении со здоровыми (табл. 2).

Было также установлено, что у пациентов с РС по сравнению со здоровыми повышен уровень В-лимфоцитов (CD19⁺-клеток) в периферической крови, p=0,025 (табл. 3).

Выявлена положительная корреляционная связь между возрастом пациентов с РС (r=0,44, p=0,045), длительностью заболевания (r=0,52, p=0,021) и уровнем экспрессии семафорина CD100 (MFI) на CD4⁺CD8⁺ Т-лимфоцитах. Показатели возраста (r=0,016, p=0,016), длительности заболевания (r=0,69, p=0,002) и количества обострений (r=0,48, p=0,046) находились в отрицательной корреляционной связи с уровнем MFI для CD72⁺ В-клеток. Показатель EDSS отрицательно коррелирует с количеством CD-клеток, несущих B-лимфоциты, моноциты и естественные клетки-киллеры (r=0,53, p=0,015). Положительная связь уровня инвалидизации по EDSS выявлена с уровнем экспрессии семафорина на CD3⁺4⁺-лимфо­цитах (r=0,45, p=0,039).

Прямая корреляционная связь обнаружена между наличием активности заболевания по данным МРТ и уровнем экспрессии семафорина CD100 (MFI) на не Т-клеточных (CD3–) популяциях лейкоцитов (r=0,71, p=0,012). Положительная связь обнаружена между количеством CD19⁺-клеток и количеством очагов на МРТ (r=0,45, p=0,037).

Таким образом, пациенты с РС отличаются от здоровых по уровню экспрессии семафорина CD100 Т-лимфоцитами периферической крови (по показателю MFI).

Ингибирование иммунных семафоринов может быть одной из возможных терапевтических мишеней для лечения некоторых иммунологически обусловленных заболеваний, в том числе РС. Подавление функции Т-клеточно-заимствованного Sema4D может предотвратить продукцию энцефалитогенных Т-клеток и смягчить уровень выраженности воспаления при его активации. Семафорины могут участвовать в процессах аксональной ремиелинизации. Вмешательство в патогенез процессов ремиелинизации при РС может способствовать отсутствию накопления неврологического дефицита и замедлению патологического процесса в ЦНС. Требуется дальнейшая оценка диагностической и прогностической значимости экспрессии уровня семафоринов при ремиттирующем течении РС и роли данных белковых молекул в инициации демиелинизации в ЦНС.