Сосудистые заболевания головного мозга и церебральный инсульт, в частности, являются одной из важнейших медицинских и социальных проблем в мире и в Российской Федерации. Острейший период церебрального инсульта сопровождается системными нарушениями обмена веществ [1, 2]. Страдают углеводный и белковый обмен, отмечается активация липолиза, нарушается утилизация жирных кислот и триглицеридов. Нарушение углеводного и белкового обмена в острейший период инсульта отрицательно коррелирует с выживаемостью, восстановлением функциональных возможностей и качества жизни пациентов. Во многих случаях именно наличие и выраженность нарушений гомеостаза определяют прогноз заболевания [3-5].

Большое значение в возникновении и исходе инсульта наряду с другими факторами риска играет психоэмоциональный стресс. Экспериментальные исследования показывают, что стресс, предшествовавший инсульту, отрицательно влияет на течение и исход заболевания [6]. У животных, перенесших стресс до инсульта, наблюдается выраженная активация катехоламинергических зон, происходят стимуляция гиппокампа, миндалин и гипоталамических структур с одновременным торможением областей префронтальной коры [7], изменение экспрессии генов раннего ответа и нарушение белкового, углеводного и жирового обмена [8]. В клинических условиях инсульт, развившийся на фоне эмоционального напряжения, также протекает более тяжело и чаще заканчивается летальным исходом [9]. Метаболическая реакция на стресс проявляется снижением или прекращением синтеза органных белков, и, несмотря на ускоренный синтез белков «острой фазы», в большинстве случаев наблюдается отрицательный азотистый баланс [1, 5]. Нарушения белкового обмена, в том числе снижение содержания альбумина в сыворотке, являются одним из прогностических маркеров тяжести состояния при неотложных и критических состояниях [10, 11]. Снижение уровня белка и альбумина в первые дни инсульта отражает тяжесть состояния и позволяет прогнозировать замедление восстановления неврологических функций в последующие дни заболевания [3, 12]. В экспериментальных исследованиях установлено, что содержание и свойства альбумина в сыворотке зависят не только от инсульта, но и предшествующего ему психоэмоционального стресса. Эти изменения чаще всего представлены посттрансляционной модификацией альбуминовой глобулы и, соответственно, нарушением конформационного состояния ее центров [13]. Изменения связывающих и конформационных свойств альбумина наиболее детально изучены при остром инфаркте миокарда и других острых коронарных состояниях [14, 15]. Вопрос о влиянии инсульта, в том числе с предшествовавшим ему психоэмоциональным стрессом, на конформационное состояние альбумина в сыворотке крови человека практически не исследован.

Цель данного исследования - изучение содержания и свойств альбумина в сыворотке и особенностей его конформационной структуры, в частности состояния связывающих центров, у больных с геморрагическим инсультом.

Обследованы 59 пациентов, 27 женщин и 32 мужчины (средний возраст - 59,7±8,3 года), с геморрагическим инсультом.

У всех больных геморрагический инсульт, локализовавшийся в больших полушариях головного мозга, был подтвержден данными компьютерной томографии (КТ) головного мозга, проведенной в 1-3-й дни заболевания. Средний объем гематомы составил 32,5±9,2 см³. Все пациенты наблюдались в условиях отделения интенсивной терапии и реанимации, где им проводилась терапия, включавшая дифференцированное и базисное лечение.

Состояние больных при поступлении и в динамике оценивалось на основании шкалы комы Глазго - ШКГ (на 1-е и 3-е сутки) и Скандинавской шкалы инсульта - СШИ (на 1, 3, 7, 14-е и 21-е сутки), функциональный исход заболевания к 28-30-м суткам - на основании индекса Бартел. Наличие и степень выраженности психоэмоционального стресса, предшествовавшего инсульту, анализировалось по анамнестическим указаниям, шкале стрессовой устойчивости и социальной адаптации Холмса-Рея и вопроснику Ридера. К группе больных, перенесших эмоциональный стресс, относились пациенты, у которых показатель по шкале Холмса-Рея составил 150-300 баллов, а по опроснику Ридера - более 19 баллов. При невозможности контакта с больным опрашивались родственники. Кроме психоэмоционального стресса в качестве факторов, влияющих на исход заболевания, анализировались возраст, пол, употребление алкоголя, курение, объем и локализация гематомы и перифокального отека, наличие и объем крови в желудочковой системе, смещение срединных структур и развитие окклюзионной гидроцефалии.

При поступлении, а затем на 3, 7, 14-е и 21-е сутки заболевания изучалась динамика лабораторных показателей, отражающих белковый, углеводный и жировой обмен: содержание в крови общего белка, альбумина, мочевины, креатинина, холестерина и глюкозы. На 5-е сутки заболевания однократно исследовалась степень перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной активности плазмы: концентрация малонового диальдегида и лактоферрина, активность каталазы и церулоплазмина. Кроме этого, у 26 пациентов, 12 женщин и 14 мужчин, были исследованы конформационные свойства альбумина - в день развития заболевания, а затем на 7-е и 21-е сутки.

Состояние альбуминовых центров исследовали с использованием флуоресцентного зонда - производного диметиламинонафталевой кислоты (К-35, CAPIDAN) [13, 16]. Этот зонд при добавлении в сыворотку крови избирательно связывается и флуоресцирует из альбумина, что позволяет изучать этот белок без его выделения из сыворотки и, следовательно, без нарушения его нативности.

Измеряли следующие параметры: 1) интенсивность флуоресценции К-35 из альбумина в N-конформации белка при рН 7,4 (будучи выражен в г/л, этот показатель называется ЭКА - эффективная концентрация альбумина); в этих условиях интенсивность флуоресценции зонда зависит от степени модификации главных связывающих центров альбумина; 2) интенсивность флуоресценции К-35 из альбумина в F-конформации белка при рН 4,2 в присутствии неионного детергента бридж-35; в этих условиях интенсивность флуоресценции зонда не зависит от степени модификации главных связывающих центров альбумина, что позволяет определить концентрацию этого белка в сыворотке (ОКА, общая концентрация альбумина, г/л). Показатель ЭКА/ОКА не зависит от концентрации альбумина и отражает степень модификации связывающих центров [16]. В норме отношение ЭКА/ОКА=1.

Также был использован более тонкий метод изучения связывающих центров - тушение флуоресценции зонда К-35, связанного с альбумином. Суть этого явления состоит в уменьшении интенсивности флуоресценции вещества (лиганда, зонда) при его взаимодействии с другим веществом - тушителем, например при диффузионном столкновении с ним или при образовании нефлуоресцирующего комплекса. По степени тушения можно судить об условиях взаимодействия между флуорофором и тушителем. Если флуорофор связан с белком, то на эффективность тушения влияют динамические и пространственные свойства связывающей области белковой молекулы, определяющие степень доступности связанного зонда для тушителя.

Тушение флуоресценции зонда, связанного с альбумином, осуществляли с помощью смесей, содержащих KNO3 и KCl в различных пропорциях: к 1,5 мл сыворотки, разбавленной в 20 раз фосфатным буферным раствором (рН 7,4), добавляли 0,5 мл смеси. Агентом, тушащим флуоресценцию, являлся ион нитрата. Его конечная концентрация в пробах варьировала от 0 до 0,5 моль/л. Хлорид калия служил для поддержания одинаковой ионной силы образцов, которая составляла 0,635 моль/л.

Полученные зависимости интенсивности флуоресценции зонда от концентрации тушителя анализировали с применением модели Лерера. В рамках этой модели уменьшение интенсивности флуоресценции зонда при добавлении тушителя описывается двумя параметрами: бимолекулярной константой тушения (Кт) и долей «вытушиваемой» флуоресценции (f):

где F₀ и F - интенсивность флуоресценции зонда в отсутствие тушителя и при бесконечной его концентрации соответственно. На графике зависимости

F₀/(F₀-F) от 1/[KNO₃] отрезок, отсекаемый на вертикальной оси, равен 1/f, а наклон прямой составляет 1/(f·KТ).

Зарядовые взаимодействия играют важную роль в поддержании конформации альбумина и во взаимодействии лиганд (зонд) - белок. Для этого флуоресценцию зонда измеряют при двух ионных силах: более низкой, когда зарядовые взаимодействия проявляются сильнее, и при более высокой, когда они ослабевают вследствие экранирования ионами заряженных групп. Мы оценивали эффект зарядов по параметру F₀/ЭКА (отн. ед.), поскольку параметр F₀ измеряется при высокой ионной силе, а ЭКА - при физиологической (рН в обоих случаях 7,4). Чем меньше значение F₀/ЭКА, тем выше вклад электростатических сил во взаимодействие зонд-белок.

Величины как F₀, так и ЭКА зависят от степени модификации гидрофобной составляющей связывающих центров. Поэтому их отношение к ней слабочувствительно. Однако другой показатель -F₀/ОКА (отн. ед.) - чувствителен к нарушению обеих составляющих сил, определяющих белок-лигандные взаимодействия - и гидрофобной, и электростатической. Чем выше показатель F₀/ОКА, тем сильнее нарушена (при равном вкладе зарядов) гидрофобная составляющая, и тем сильнее, как ожидается, повреждена «внутренность» глобулы.

Статистический анализ полученных данных проведен с помощью программного пакета SPSS 6.0 с использованием параметрических и непараметрических методов. Статистическая обработка материала включала сравнительный анализ групп пациентов с предшествующим психоэмоциональным стрессом и без него, кроме этого, результаты, полученные при исследовании конформационных свойств альбумина, сопоставлялись с нормативными показателями, полученными на здоровых добровольцах. Различия считались достоверными при р<0,05.

Из 59 обследованных у 27 пациентов непосредственно перед заболеванием отмечался эмоциональный стресс. В 32 наблюдениях геморрагический инсульт развился без предшествовавшего стресса, и эти больные составили группу сравнения. Во время пребывания в стационаре умерли 15 больных, в том числе 9 в группе с предшествовавшим стрессом и 6 в группе без стресса.

При сравнении группы, перенесшей эмоциональный стресс, и группы без стресса достоверных различий по полу и возрасту, частоте сопутствующих заболеваний, курения и употребления алкоголя не выявлено (см. таблицу).

Известно, что инсульт, развившийся на фоне стресса, сопровождается более тяжелым течением и худшим функциональным восстановлением [4, 9]. В настоящем исследовании частота и выраженность нарушений сознания и тяжесть состояния, оцененные по ШКГ и СШИ, при поступлении не различались между группами (см. таблицу), однако к 3-м суткам заболевания начинали формироваться различия. К этому времени частота нарушений сознания между группами по-прежнему не различалась, однако в группе без предшествовавшего стресса имевшиеся нарушения сознания были меньшей степени выраженности, что находило отражение в несколько большей сумме баллов по ШКГ по сравнению с суммой баллов в группе со стрессом (11,7±2,3 и 10,6±2,1 балла соответственно). При анализе выраженности очаговых неврологических симптомов по СШИ на 3-и сутки заболевания различия в сумме баллов между группам отсутствовали. На 7-й день заболевания проявилась тенденция к меньшей выраженности неврологического дефицита в группе без стресса, у пациентов с предшествующим стрессом сумма баллов по СШИ составила 33,1±7,9, а в группе сравнения - 36,8±8,9. На 21-й день различия по СШИ достигали достоверных значений - 44,5±8,2 и 48,7±7,6 балла соответственно (р=0,046). Суммарное значение индекса Бартел на 28-30-й дни заболевания было также больше в группе без стресса: группа без стресса - 74,5±12,5 балла, группа со стрессом - 69,2±11,9 балла, однако эти различия оказались недостоверными. Таким образом, психоэмоциональный стресс, предшествующий геморрагическому инсульту, был ассоциирован с менее благоприятным течением заболевания.

Одними из лабораторных показателей, отражающими тяжесть состояния и позволяющими прогнозировать исход заболевания [10, 11], в том числе у больных с инсультом [3, 12], являются содержание общего белка и альбумина. Уровень альбумина был исследован у 19 пациентов со стрессом и у 25 пациентов без стресса. Снижение содержания альбумина к 3-м суткам заболевания отмечалось у всех больных, при этом достоверных различий между группами со стрессом и без - не получено. В обеих группах имелась связь между уровнем альбумина и исходом заболевания, и снижение содержания альбумина у умерших больных (вне зависимости от наличия или отсутствия стресса) было более выражено, чем у выживших (14,4±4,8 и 11,7±4,2 г/л соответственно, р=0,043). Ассоциация между уровнем альбумина и тяжестью состояния у больных с церебральным инсультом может быть связана с его антиоксидантными и нейропротективными свойствами [17, 18]. Кроме этого, в 1-ю неделю заболевания отмечена отрицательная связь между содержанием альбумина и выраженностью и продолжительностью повышения уровня глюкозы (r>–0,28, p<0,023). Это может быть объяснено тем, что антиоксидантная активность альбумина зависит от его концентрации в плазме и от третичной конфигурации его молекулы, а гипергликемия может способствовать конформационной перестройке молекулы и снижению антиоксидантных и нейропротективных свойств альбумина [19].

Наряду с оценкой общей концентрации альбумина у 26 пациентов (11 больных со стрессом и 15 - без стресса) были изучены ЭКА и ее отношение к ОКА, а также динамика электростатических взаимодействий. Известно, что изменение состояния активных центров молекул, и белков в том числе, может существенно сказываться на их функциональной активности и свойствах даже при высоком содержании исследуемого вещества в биологических образцах [20, 21].

При изучении ЭКА установлены различия в динамике этого показателя между группами. Изначально ЭКА не различалась между группами (рис. 1, а), однако к 7-му дню заболевания снижение ЭКА в группе без стресса было достоверно больше, чем у больных, у которых инсульту предшествовал стресс (10,2±4,4 и 4,5±2,7 соответственно, р=0,002).

Отношение ЭКА/ОКА и динамика его изменения также различались между группами. В норме это отношение составляет 1,0, изменение показателя отражает нарушение пространственной структуры альбумина. Исходно у всех больных с инсультом отношение ЭКА/ОКА было ниже 1,0, что указывало на самостоятельное значение инсульта в изменении пространственной структуры молекулы альбумина и ее связывающих центров. Наличие изменений в состоянии связывающих центров молекулы альбумина было ранее показано при некоторых других острых и неотложных состояниях. Так, модификация активности связывающих центров N-области альбумина для переходных металлов, в частности для кобальта, меди и никеля, наблюдается у больных с острым коронарным синдромом, появление этих изменений связывается с накоплением недоокисленных продуктов метаболизма при ишемии миокарда [14, 15]. Изучение влияния предшествующего инсульту стресса показало, что его наличие еще в большей степени нарушало исходное отношение ЭКА/ОКА (см. рис. 1, б). Кроме этого, наличие предшествующего стресса меняло динамику отношения ЭКА/ОКА в последующие дни заболевания. В группе без стресса к 7-м суткам заболевания отношение ЭКА/ОКА снижалось достоверно больше, чем у больных со стрессом (р=0,014) и затем до конца 3-й недели заболевания стабилизировалось на определенном уровне, в то время как у больных с предшествовавшим инсульту стрессом отмечалось монотонное снижение отношения ЭКА/ОКА на протяжении всего наблюдения (см. рис. 1, б). Выявленные различия, вероятно, отражали уменьшение компенсаторных возможностей и сохраняющиеся нарушения метаболизма у больных с предшествующим стрессом.

Измерение реакции тушения флуоресценции показало, что в 1-е сутки заболевания величина Кт и доля невытушиваемой флуоресценции - основной параметр «доступности», были достоверно снижены у всех больных по сравнению со здоровыми (в норме Кт=2,0) (рис. 2, а, б).

Исследование динамики показателей F₀/ЭКА и F₀/ОКА (рис. 3, а, б) выявило усиление вклада электростатических (зарядовых) взаимодействий у всех больных на 7-е сутки заболевания, что отражалось достоверным снижением показателя F₀/ЭКА на 7-е сутки в обеих группах (см. рис. 3, а).

Таким образом, у больных с геморрагическим инсультом, так же как и при ишемическом инсульте [9], предшествующий эмоциональный стресс ассоциировался с менее благоприятным течением заболевания, более выраженными неврологическими симптомами и более медленным восстановлением нарушенных функций. Кроме этого, как и в ряде предыдущих исследований, выполненных у больных, находящихся в тяжелом состоянии [10-12], установлена связь между уровнем альбумина и прогнозом заболевания. Протективное значение высокого уровня альбумина в крови может быть связано с тем, что этот белок на 70-80% обусловливает величину онкотического давления в плазме крови и обладает выраженными связывающими и детоксицирующими свойствами, а внутривенное введение альбумина в течение первых часов инсульта уменьшает объем необратимого ишемического повреждения и перифокального отека [17]. Развитие инсульта влияло также на изменение пространственной конфигурации молекулы альбумина и на ее связывающие свойства. Показано, что изменение пространственной структуры молекулы альбумина, наряду с его общим содержанием в крови, может существенно влиять на его способность связываться с низкомолекулярными метаболитами и веществами, находящимися в плазме [21]. Наряду с инсультом самостоятельное влияние на изменение структуры молекулы альбумина имел предшествующий стресс. Это определялось по исходному более низкому отношению ЭКА/ОКА, Кт и доли невытушиваемой флуоресценции у больных со стрессом, по сравнению с пациентами без стресса, а также по динамике изменения F0/ОКА на протяжении заболевания. Возможность влияния стресса на конформационные свойства альбумина была ранее показана в экспериментальных исследованиях [13]. Одним из наиболее значимых факторов, способствовавших изменению конфигурации молекулы альбумина в обеих группах, мог быть окислительный стресс, при котором наблюдаются повышение содержания свободных жирных кислот и гипергликемия [19, 22, 23].