Отграниченная гемангиома хориоидеи (ОГХ) — редкая доброкачественная внутриглазная опухоль, чаще всего представленная в виде солитарного розоватого узла, локализованного в заднем полюсе глазного дна [1, 2]. Первые симптомы заболевания проявляются во взрослом возрасте, обычно на четвертой декаде жизни, когда у пациентов выявляют суб- или интраретинальный экссудат в макулярной области, что приводит к резкому снижению остроты зрения [3—5]. В ряде случаев диагноз устанавливают на основании данных офтальмоскопии [6, 7]. Однако в большинстве случаев применяют инструментальные методы исследования, такие как эхография, флюоресцентная ангиография и оптическая когерентная томография (ОКТ), в том числе в ангиографическом режиме [8—11].

Наиболее часто при подозрении на ОГХ проводят дифференциальную диагностику с другими внутриглазными новообразованиями, прежде всего начальной беспигментной увеальной меланомой [12—14].

Помимо вышеперечисленных клинических и инструментальных методов исследования, в последние годы особое внимание уделяется молекулярно-генетическим исследованиям в дифференциальной диагностике внутриглазных новообразований [15, 16]. В то же время полученные данные зачастую носят разноречивый характер, а сами исследования единичны. В связи с существенными различиями в тактике хирургического лечения, наблюдения и витального прогноза больных с ОГХ и беспигментной меланомой хориоидеи (МХ) в настоящее время существует потребность в малоинвазивном способе молекулярно-генетической дифференциальной диагностики указанных внутриглазных новообразований.

Цель работы — разработка способа неинвазивной молекулярно-генетической дифференциальной диагностики ОГХ и беспигментной МХ.

Материал и методы

Всего в исследование включено 90 человек. В опытную группу включено 30 пациентов с ОГХ. Группу сравнения составили 30 пациентов с беспигментной МХ. В группу контроля вошло 30 относительно здоровых человек без внутриглазных новообразований и других опухолей. Гендерное распределение в опытной группе и группе сравнения характеризовалось преимуществом женщин (n=32; 53,3%) по сравнению с мужчинами (n=28; 46,7%). Возрастной диапазон составил от 20 до 86 лет (в среднем 53,2±7,4 года).

Всем пациентам проводили стандартное и инструментальное офтальмологическое обследование в условиях отдела офтальмоонкологии и радиологии и взрослого консультативно-поликлинического отделения ФГБУ «НМИЦ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России. Инструментальное обследование включало ультразвуковое исследование на многофункциональной ультразвуковой системе Voluson 730Pro (General Electric, Healthcare, Германия) и спектральную ОКТ в режиме улучшенного глубокого изображения EDI на ретиноангиотомографе HRA+OCT (Heidelberg, Германия). Все пациенты находились под динамическим наблюдением.

Молекулярно-генетическое исследование проводили на базе лаборатории патогеномики и транскриптомики НИИ общей патологии и патофизиологии. От всех больных было получено добровольное информированное согласие на медицинские процедуры. Материалом исследования служила геномная циркулирующая опухолевая ДНК (цоДНК), выделенная из плазмы периферической крови с помощью протеиназы K с последующей фенольно-хлороформной экстракцией и осаждением этанолом. Выделенные образцы ДНК хранили при температуре –20 °C. Качественную и количественную оценку ДНК проводили на спектрофотометре NanoDrop 1000 (NanoDrop, США). Изучение мутаций в генах GNAQ/GNA11 выполняли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США) методом анализа кривых плавления. Амплификацию проводили согласно протоколу для использованного набора и программным настройкам Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1х qPCRmix-HS SYBR, по 0,4 мкМ каждого праймера (см. таблицу), 50—100 нг ДНК матрицы, в 96-луночных планшетах Optical Reaction Plate по следующей программе: предварительная денатурация: 1 цикл, 95 °C, 5 мин; ПЦР: 40 циклов (95 °C — 30 с; 60 °C — 30 с; 72 °C — 30 с). Последовательности олигонуклеотидных праймеров и условия проведения ПЦР приведены в таблице.

Характеристика праймеров и условий ПЦР

Примечание. Т_отж — температура отжига; п. н. — пары нуклеотидов.

Плавление продуктов амплификации выполняли в диапазоне 55—95 °C с увеличением температуры на 0,5 °C каждые 10 с (рис. 1). Обработку полученных данных осуществляли в программной среде Precision Melt Analysis Software (Bio-Rad).

Рис. 1. Пример анализа мутации Glu209Pro (А209С) в гене GNAQ с использованием кривых плавления.

а — кривые накопления продукта ПЦР для мутации Glu209Pro (А209С) в гене GNAQ в реальном времени; б — температурные кривые плавления продукта ПЦР для мутации Glu209Pro (А209С) в гене GNAQ. АА — контроль «верхнего» гомозиготного генотипа (норма); АС — контроль гетерозиготного генотипа; СС — контроль «нижнего» гомозиготного генотипа (минорная гомозигота).

Статистическая обработка результатов исследования выполнена с использованием приложения Microsoft Excel 2010 и статистической программы Statistica 10.1 (StatSoft Inc., США). Проведен расчет среднего арифметического значения (М), стандартного отклонения от среднего арифметического значения (SD), минимальных и максимальных значений. Для оценки значимости полученных результатов при сравнении средних показателей использовался t-критерий Стьюдента. При сравнении частот встречаемости признака использовался точный критерий Фишера. Различия между выборками считали значимыми при p<0,05, доверительный интервал 95%.

Результаты и обсуждение

Отграниченная гемангиома хориоидеи на глазном дне офтальмоскопически представлена проминирующим беспигментным очагом рогового или красноватого цвета (сливающимся с фоном глазного дна), округлой или овальной формы, с ровными, нечеткими границами, ровной поверхностью, локализующейся в центральном отделе заднего полюса глаза (рис. 2, а). Размеры опухоли по уровню проминенции варьировали от 0,9 до 3,0 мм (медиана — 2,4 мм; диаметр основания — от 5,2 до 12,2 мм, медиана — 8,3 мм). На глазном дне преимущественно встречались ОГХ юкстапапиллярной локализации (n=22; 73,3%) с распространением на макулярную область (n=11; 36,7%), с отслойкой или без отслойки сетчатки. Преобладала локализация в наружной половине глазного дна (n=24). ОГХ во внутренней половине встречалась в шести случаях, при этом, по данным компьютерной периметрии, выявляли относительную скотому, соответствующую локализации образования на глазном дне. В 11 (36,7%) случаях выявлена ОГХ с плоской распространенной отслойкой сетчатки в центральной зоне глазного дна, что сопровождалось значительным снижением остроты зрения, жалобами на искажение предметов, реже — появлением метаморфопсий или темного пятна в центральной зоне поля зрения. За редким исключением (n=2) течение заболевания происходило бессимптомно и выявлено случайно во время прохождения пациентом профилактического медицинского осмотра.

Рис. 2. ГХ с претуморальным экссудатом и перифокальной отслойкой сетчатки (а) и беспигментная МХ с выраженным претуморальным экссудатом и кистовидной отслойкой сетчатки по периферии опухоли (б).

Одним из частых признаков, сопровождающих ОГХ, явилось наличие субретинального прозрачного экссудата (n=22), фиброзного перерождения пигментного эпителия (ПЭ; n=13) в виде белесоватой ажурности сетчатки или беловатых участков в сетчатке над опухолевым узлом, мелких плотных друз (n=11), перераспределения ПЭ в виде мелких полей пигмента и/или плотных образований по типу костных телец (n=10), а также пролиферации ПЭ по краю опухолевого узла в виде широкой каймы зеленоватого цвета (n=10); в двух случаях выявлены поля оранжевого пигмента сетчатки над зоной опухолевого узла.

Размеры малых беспигментных МХ по уровню проминенции варьировали от 1,2 до 3,3 мм (медиана — 2,6 мм; диаметр основания — от 5,9 до 13,1 мм, медиана — 9,0 мм). Следует отметить, что при беспигментной МХ, особенно малых и средних размеров, часто встречаются перераспределение ПЭ в виде мелких и средних полей, крапчатости, пролиферация ПЭ в виде окаймляющего венчика зеленоватого или аспидного цвета, отложение мелких или сливных плотных друз, поля оранжевого пигмента в сетчатке над опухолевым узлом (рис. 2, б).

Для МХ и гемангиомы хориоидеи (ГХ) наиболее распространенной является куполообразная или так называемая чечевицеобразная форма (78,2 и 95% соответственно), что подтверждает узловой характер роста.

Варианты эхогенности ОГХ и МХ могут быть различными: средняя или повышенная (гиперэхогенная) при ОГХ и от низкой (гипоэхогенной) до умеренно повышенной при МХ (рис. 3, а, б).

Рис. 3. Результат ультразвукового исследования в серошкальном B-режиме.

а — ГХ (гиперэхогенное образование однородной структуры); б — МХ (гипоэхогенная неоднородная структура).

Характерная эхографическая экскавация хориоидеи при увеальной меланоме (УМ) чаще встречается при больших опухолях (в 66% случаев). Из-за особенностей анатомической локализации ГХ в ряде случаев (72%) удается визуализировать основание опухоли (ложе) на фоне «неизмененной» хориоидеи. Полученные нами эхографические особенности ОГХ соответствовали таковым в работе А.Ф. Бровкиной и соавт. [8].

Для ОГХ характерны высокие денситометрические показатели (в среднем 156,8±22,9 усл.ед.; рис. 4, а). УМ может иметь различные денситометрические характеристики, более высокие значения наблюдаются при гиперваскулярных вариантах опухоли. Значение акустической плотности УМ составляет в среднем 85,6±29,3 усл.ед. (рис. 4, б, в).

Рис. 4. Определение акустической плотности в режиме двухмерной тканевой гистограммы: повышенные показатели акустической плотности при ГХ (а); пониженные (б) и повышенные (в) показатели акустической плотности при МХ.

Для ОГХ и МХ характерен гиперваскулярный вариант кровоснабжения, расположение сосудов преимущественно хаотичное, особенно при ГХ (рис. 5, а, б). По характеру спектра внутриопухолевого кровотока одинаково часто определяется артериальный и смешанный артериовенозный кровоток. Для ОГХ характерны два основных типа ангиоархитектоники: 1) равномерное распределение цветовых картограмм потоков по всей проекции опухоли (46,7%); 2) распределение по «периферии» опухолевого очага (53,3%). МХ характеризуются большей вариабельностью ангиоархитектоники: 1) равномерное распределение цветовых картограмм потоков в 30% наблюдений; 2) в центральной части опухоли (33%); 3) распределение по «периферии», или краям опухолевого очага (37,0%).

Рис. 5. Результат ультразвукового сканирования в режиме цветового допплеровского картирования: равномерное распределение цветовых картограмм, ангиоархитектоника.

а — ГХ; б — МХ.

Гемодинамические показатели представленных опухолей хориоидеи разнообразны (рис. 6, а, б). Скоростные показатели (V_ps, V_ed, TAMX) внутриопухолевого кровотока ГХ бывают от низко- до высокоскоростных, а индексы периферического сопротивления, отражающие периферическое сопротивление (RI, PI), преимущественно низкие.

Рис. 6. Спектр допплеровского сдвига частот кровотока в собственных сосудах.

а — ГХ; б — МХ.

Пиковая систолическая скорость кровотока (V_ps) в сосудах ОГХ соответствовала медиане 12,61 [8,8; 15,9] см/с, максимальная конечная диастолическая скорость (V_ed) соответствовала медиане 2,973 [1,7; 7,75] см/с, индекс периферического сопротивления (RI) составлял 0,73 [0,59; 0,88]. Это предполагает наличие относительно «крупных» сосудов в проекции опухоли и является качественной характеристикой васкуляризации.

По данным ОКТ при ОГХ отмечаются элевация хориоидального профиля в зоне локализации опухоли, уплотнение слоя ПЭ на всем протяжении зоны элевации, на вершине опухоли в 81% случаев определяются частичное разрушение ПЭ в виде мелких депозитов, утолщение слоя нейроэпителия (НЭ) с кистозным компонентом в 68% случаев от множественных средних или мелких до гигантских сливных кист (рис. 7). При беспигментной МХ также определяются уплотнение ПЭ, разрушение ПЭ в виде депозитов, кисты и отслойки НЭ (рис. 8).

Рис. 7. Оптическая когерентная томограмма ОГХ.

Рис. 8. Оптическая когерентная томограмма МХ.

Следует отметить, что при беспигментной МХ, особенно при малых опухолях, встречаются те же офтальмоскопические, эхографические и морфометрические признаки, как и при ОГХ, что затрудняет дифференциальный поиск. Исследуемые рутинные методы исследования находятся в определенной зависимости как от состояния глаза и его сред, так и от опытности клинициста. Все это заставляет искать новые, более совершенные методы диагностики внутриглазных новообразований.

Проведенное молекулярно-генетическое исследование позволило выявить значимую связь мутаций в экзонах 4 и 5 генов GNAQ/GNA11 с наличием беспигментной МХ (27/30; 90%). В группе пациентов с ОГХ указанные мутации не выявлены. В контрольной группе у здоровых лиц мутации в экзонах 4 и 5 генов GNAQ/GNA11 также не выявлены.

Известно, что МХ является внутриглазным новообразованием, характеризующимся мутациями GNAQ и GNA11 [17—19]. В ряде исследований показано, что мутация GNAQ/GNA11 происходит на ранней стадии, а клональная экспансия может произойти только после мутации GNAQ/GNA11 в клетках опухоли [20, 21]. В исследовании на животных показана возможность создания экспериментальной модели при наличии мутации GNA11, что подтверждает роль данной мутации в онкогенезе МХ [22]. GNAQ и GNA11 кодируют гетеротримерный гуаниновый нуклеотид-связывающий белок G (субъединицы альфа q и 11 соответственно). Мутации в GNAQ и GNA11 происходят исключительно в кодоне 183 (экзон 4) или 209 (экзон 5), что приводит к конститутивной активации митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) [17]. Многие терапевтические исследования были направлены на ингибирование GNAQ/GNA11 или его мишеней, расположенных ниже по сигнальному пути [23, 24].

В доступной литературе нам удалось найти две работы, посвященные анализу частоты мутаций GNAQ/GNA11 при ГХ. J.H. Francis и соавторы изучали образцы тканей с применением метода секвенирования нового поколения от 11 пациентов со следующими диагнозами: пламенеющий невус (n=3), диффузная ГХ (n=1), солитарная ГХ (n=6) и невус хориоидеи (n=1). Активирующие соматические мутации GNAQ (c.547C>T; p.Arg183Cys) были обнаружены в 100% (три из трех) пламенеющих невусов и в диффузной ГХ. Соматические мутации GNAQ (c.626A>T; p.Gln209Leu) выявлены в 100% (шесть из шести) солитарных ГХ и в невусе хориоидеи (c.626A>C; p.Gln209Pro). Авторы заключили, что мутации GNAQ встречаются как в диффузных, так и в солитарных ГХ, хотя и в разных кодонах. В диффузных ГХ мутирует кодон R183, что соответствует другим сосудистым мальформациям Штурге—Вебера. Напротив, солитарные ГХ характеризуются мутациями в кодоне Q209, что соответствует другим внутриглазным меланоцитарным новообразованиям [16]. В нашей работе мутации выявляли методом ПЦР в режиме реального времени в периферической крови, при этом у пациентов с ОГХ мутации GNAQ/GNA11 не выявлены.

C.H.D. Le Guin и соавт. проводили анализ частоты мутаций в кодонах R183 и Q209 генов GNAQ и GNA11 в образцах тканей 33 пациентов с ОГХ, гистологически диагностированной методом секвенирования нового поколения. Всем пациентам проведена биопсия или энуклеация в период с 2008 по 2018 г. Для выявления вариантных аллелей при низких долях глубина чтения превышала 15 тыс. раз. ДНК для генетического анализа получена из образцов тканей, подвергнутых заморозке (n=22), или гистологических блоков (n=11). В образцах от 28/33 пациентов (85%) выявлена соматическая миссенс-мутация GNAQ (c.626A>G; p.Q209R). Доля аллельных вариантов была различной (диапазон от 2,3 до 28%). Авторы заключили, что мутации в кодоне 209 гена GNAQ характерны для ОГХ [15]. В нашей работе у пациентов с МХ выявляли мутации в обоих кодонах генов GNAQ/GNA11, а в группе больных ОГХ мутации не выявлены.

Ранее в серии работ нами показана возможность выявления мутаций в генах GNAQ/GNA11 с помощью анализа кривых плавления и метода определения полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ-анализ) в периферической крови [25—27]. В группах больных со стационарным невусом хориоидеи, прогрессирующим невусом хориоидеи и начальной МХ показана значимая связь наличия цоДНК (онкогены GNAQ/GNA11) и генотипа CC гена ABCB1 с риском развития начальной МХ и невусов хориоидеи. У пациентов с прогрессирующим невусом хориоидеи отмечается неблагоприятная значимость мутаций в генах GNAQ/GNA11 (цоДНК). Предположена относительная неблагоприятная прогностическая значимость наличия мутаций генов GNAQ/GNA11 в цоДНК в периферической крови пациентов со стационарным невусом хориоидеи.

Преимуществом выявления мутаций в цоДНК периферической крови является отсутствие необходимости выполнения инвазивного вмешательства (тонкоигольной аспирационной биопсии), связанного с возможными вторичными осложнениями (гемофтальм, отслойка сетчатки, снижение остроты зрения при центральной локализации опухоли, локальное распространение опухоли в месте проведения тонкоигольной аспирационной биопсии), а также снижение риска получения ложноположительных результатов при попадании в просвет иглы клеток ретинального ПЭ при биопсии ОГХ. Выполнение ПЦР в режиме реального времени с выявлением мутаций в экзоне 4 и/или 5 генов GNAQ/GNA11 позволяет также существенно сократить стоимость исследования по сравнению с секвенированием.

Заключение

Дифференциальная диагностика ОГХ и беспигментных МХ представляет определенные сложности в связи со схожестью клинической, эхографической и морфометрической картины. Даже прицельное использование дополнительных инструментальных методов исследования не выявило специфических дифференциально-диагностических критериев. В настоящей работе предложен метод неинвазивной и недорогой дифференциальной диагностики на основе молекулярно-генетического исследования и выявления специфических для МХ (90%) мутаций в экзонах 4 и 5 генов GNAQ и GNA11. У больных с ОГХ и здоровых лиц из контрольной группы указанные мутации не выявлены.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: С.С., А.Ц.

Сбор и обработка материала: Н.С., А.Ц., В.А., В.Л., А.Б.

Статистическая обработка данных: А.Ц.

Написание текста: С.С., Н.С., А.Ц., В.А., В.Л., А.Б.

Редактирование: С.С., В.Л.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.