Метод мультифокальной электроретинографии (мфЭРГ) получил широкое распространение в клинической практике и позволяет оценить топические изменения функциональной активности центральных отделов сетчатки при таких заболеваниях, как возрастная макулярная дегенерация, диабетическая ретинопатия, пигментный ретинит, тромбоз ветвей центральной вены сетчатки и др. [1—4]. Одновременно имеются ограниченные данные об использовании метода при проведении экспериментальных исследований на животных; в частности, имеются сообщения о проведении мфЭРГ в экспериментах на человекообразных обезьянах, свиньях, кроликах, крысах и мышах [5—9]. При этом регистрация мфЭРГ у разных животных в целом не отличается от таковой у человека, подробно описанной в соответствующем стандарте ISCEV [10]. В то же время проведение исследований на каждом из упомянутых видов животных сопряжено с различными трудностями, обусловленными особенностями как анатомии глаза, так и оборудования, используемого для предъявления стимула и регистрации сигнала. В частности, системы регистрации мфЭРГ, применяемые у животных, в большинстве своем разработаны для выполнения исследований у человека, поэтому в публикациях, в которых описывается исследование мфЭРГ у лабораторных животных, как правило, авторы адаптируют имеющееся оборудование под конкретную экспериментальную модель [5, 8].
Сравнительно недавно в России появился отечественный комплекс для проведения мультифокальной электроретинографии («Нейро-ЭРГ», «Нейрософт», Иваново), разработанный для использования в клинической практике. При этом в литературе практически нет каких-либо данных о его применении в экспериментах на животных.
Цель работы — изучить возможность использования комплекса «Нейро-ЭРГ (с модулем для проведения мультифокальной ЭРГ)» в исследовании очаговой и диффузной патологии сетчатки у лабораторных животных (кроликов).
Материал и методы
Работа выполнена на 10 кроликах (20 глаз) породы шиншилла (самцы массой 2,5—3 кг), из которых на 5 животных (5 глаз) моделировали очаговое повреждение сетчатки и на 5 животных (5 глаз) — диффузное повреждение сетчатки. Повреждение моделировали на правом глазу животных, при этом левый служил контролем. Все эксперименты выполнены в соответствии с международными рекомендациями по работе с лабораторными животными, Стокгольмской декларацией о гуманном обращении с лабораторными животными и одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины» Минобороны России.
Подготовка животных к воздействию и регистрации мфЭРГ. Регистрацию мфЭРГ у животных осуществляли в условиях наркоза (ксилазин 5 мг/кг и кетамина гидрохлорид 35 мг/кг внутримышечно за 15 мин до манипуляций) и медикаментозного мидриаза (циклопентолат 1%). Перед наложением роговичного электрода при записи мфЭРГ выполняли местную анестезию (оксибупрокаина гидрохлорид 0,4%). Кролика для удобства работы помещали в специальный бокс, позволявший мягко фиксировать голову наркотизированного животного в определенном положении.
Модель очагового повреждения сетчатки. Для моделирования очагового повреждения сетчатки проводили транспупиллярное воздействие лазерным излучением с длиной волны 532 нм. В зоне стимуляции паттерном при мфЭРГ всего наносили 5 лазерных аппликаций одиночными импульсами длительностью 100 мс и мощностью 30, 60, 100, 150 и 200 мВт, получая в сетчатке ожоги различной интенсивности с диаметром 80, 130, 170, 260 и 360 мкм соответственно, при этом расстояние между аппликациями составляло не менее 360 мкм (диаметр коагулята при воздействии импульса 200 мВт).
Модель диффузного повреждения сетчатки. Для моделирования диффузного фототоксического повреждения сетчатки животным в условиях мидриаза и местной анестезии накладывали векорасширитель и на расстоянии 15 см от поверхности роговицы размещали светодиодный источник освещения с площадью излучающей поверхности 300 см2, световым потоком 9500 лм, цветовой температурой 6400 К (светодиодный прожектор Feron LL-922, Россия). Воздействие осуществляли ежедневно по 8 ч (с 10:00 до 18:00) в течение 14 сут, при этом животные вне воздействия находились в условиях 12-часовой смены светового и темнового периода (9:00 и 21:00). В период воздействия глазную поверхность увлажняли раствором гипромелозы 0,3%.
Методика проведения мультифокальной электроретинографии. МфЭРГ регистрировали в соответствии со стандартом ISCEV с помощью модуля для мультифокальной электроретинографии в составе электрофизиологической установки «Нейро-ЭРГ» («Нейрософт», Россия). Запись мфЭРГ производили в одном помещении в одинаковых условиях фоновой освещенности (300 лк) с предварительной световой адаптацией в течение 1 ч. В качестве светового стимулятора использовали LCD-монитор, размещая его на расстоянии 25 см от поверхности глаза животного, при этом обследуемое животное располагали так, чтобы центр роговицы находился напротив фиксационной метки стимулятора, а плоскость монитора была параллельна фронтальной плоскости глазного яблока. Дополнительно положение глазного яблока контролировали с помощью зеркала-призмы, размещаемой перед фиксационной меткой монитора под углом 45° к оси между меткой и центром роговицы (рис. 1). Не менее чем за 15 мин до регистрации мфЭРГ производили съемку стимулируемого участка сетчатки на фундус-камере Topcon TRC300CW (Topcon, Япония). Положение глазного яблока при этом контролировали, располагая оптические центры роговицы и объектива камеры на одной оси, а фронтальную плоскость глазного яблока — параллельно плоскости объектива камеры, при этом диск зрительного нерва занимал положение 12 ч условного циферблата как на фото, так и на записи мфЭРГ (рис. 2). В качестве активного электрода использовали ретинографический электрод «крючок», закрепляя его за нижнее веко. Референтный и заземляющий электроды располагали на ушных раковинах кролика. Место положения активного, референтного и заземляющего электродов сохранялось без изменений в ходе всего эксперимента. Сопротивление под активным электродом не превышало 0,2 кОм, под референтным и заземляющим — 1 кОм.
Рис. 1. Общий вид экспериментального животного во время сеанса регистрации мультифокальной электроретинограммы.
а — перед началом регистрации: положение глазного яблока контролируется с помощью призмы у точки фиксации на мониторе (белые стрелки) и видеокамеры; б — при проведении регистрации: дополнительный контроль положения глазного яблока с помощью видеокамеры (красные стрелки).
Рис. 2. Проекция паттерна стимулятора на глазном дне кролика.
Предъявляемый паттерн высокого разрешения состоял из 61 ячейки гексагональной формы и охватывал 30° поля зрения. Коэффициент усиления сигнала составил 100 000, полоса пропускания усилителя — 2—200 Гц. М-последовательность представляла собой псевдослучайное предъявление темного или светлого стимула в гексагоне с частотой 75 Гц при средней яркости светлого и темного стимула соответственно 200 и 1 кд/м2 и контрастности 99,3%. Время записи в каждом сегменте составляло 13,65 с, всего было усреднено 511 стимулов M-последовательности в 8 циклах записи. При анализе в ответе первого порядка оценивали амплитуду (мкВ) пика P1 и латентность (мс) пиков P1 и N1 в разные периоды наблюдения, а также изменение ретинальной плотности биоэлектрического ответа пика P1 (нВ/град2). При очаговом воздействии оценивали показатели в гексагонах, соответствующих зоне очагового повреждения, а при диффузных изменениях оценивали изменения средних значений показателей по всему паттерну.
В качестве контроля при оценке очаговых изменений использовали значения показателей в интактных гексагонах в глазах с моделируемым воздействием (контроль 1) и в гексагонах, соответствующих зонам лазерного воздействия, на парных (интактных) глазах (контроль 2). В качестве контроля при моделировании диффузного повреждения сетчатки использовали результаты записи мфЭРГ на парных (интактных) глазах. Запись мфЭРГ осуществляли перед воздействием, через 1 ч, 1 и 7 сут после воздействия при моделировании очаговых повреждений и через 1, 7 и 14 сут после начала воздействия при моделировании диффузного повреждения.
Для того чтобы определить уровень возможной вариабельности результатов регистрации мфЭРГ у животных в течение эксперимента, у каждого животного перед началом эксперимента и по завершении периода наблюдения (или воздействия) производили три записи мфЭРГ с интервалом в 15 мин в стандартных условиях тестирования, в которых сравнивали уровень отклонения показателя амплитуды пика P1 на усредненной по результатам 61 записи кривой (S).
Статистический анализ. Анализ результатов производили с помощью пакета программ Statistica 10.0 («Stat Soft Inc.», США) с использованием непараметрических методов. Результаты представлены в виде M±SD. Анализ различия значений показателей в разные периоды тестирования проводили с использованием критерия Уилкоксона. При сравнении значений между опытной и контрольной группами использовали критерий Манна—Уитни. При анализе связи между показателями использовали расчет коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Статистически достоверными считали результаты с уровнем значимости меньше 0,05.
Результаты
Моделирование очаговой патологии. При моделировании очаговой патологии на глазном дне были получены в зависимости от энергии импульсов различные по интенсивности, глубине и площади ожоги (рис. 3, а), при этом наблюдаемый диаметр ожогов прямо коррелировал с энергией импульсов (r=0,98 при p=0,001). При проведении мфЭРГ было выявлено изменение биоэлектрической активности в гексагонах, соответствующих участкам поражения сетчатки (табл. 1; см. рис. 3, б—г).
Рис. 3. Результаты мфЭРГ при моделировании очагового повреждения сетчатки.
а — глазное дно через 1 ч после воздействия лазерным излучением 0,532 мкм: 1 — 30 мВт, 2 — 60 мВт, 3 — 100 мВт, 4 — 150 мВт, 5 — 200 мВт; б, в, г — результаты регистрации фона (до начала воздействия), через 1 и 7 сут после начала светового воздействия соответственно. Красные гексагоны — проекция зон повреждения, синие гексагоны — зоны контроля при анализе (контроль 1, объяснение в тексте).
При энергии импульса 30 мВт офтальмоскопически поражение соответствовало пороговому уровню термического воздействия: едва наблюдаемое при осмотре через 1 ч после воздействия побледнение сетчатки, обусловленное ее отеком, не визуализируемое через 24 ч после воздействия. Площадь зоны воздействия на сетчатке составляла 10—15% площади соответствующего гексагона, при этом как непосредственно после воздействия, так и через 7 сут не было выявлено каких-либо значимых изменений параметров мфЭРГ относительно значений фона (см. табл. 1).
Таблица 1. Результаты мфЭРГ при моделировании очагового повреждения сетчатки при воздействии лазерного излучения 0,532 мкм при длительности импульса 100 мс
| Период наблюдения | Энергия импульса, мДж | Контроль | |||||
| 30 | 60 | 100 | 150 | 200 | |||
| средний диаметр коагулята, мкм | |||||||
| 79,8±4,2 | 131±6,4 | 169,8±9,9 | 262±11,9 | 357,4±29,1 | 1 | 2 | |
| Амплитуда P1, мкВ | |||||||
| фон | 0,29±0,04 | 0,26±0,05 | 0,31±0,03 | 0,31±0,02 | 0,3±0,06 | 0,28±0,05 | 0,28±0,05 |
| 1 ч | 0,29±0,05 | 0,22±0,04* | 0,24±0,04* | 0,20±0,05* | 0,15±0,04* | 0,29±0,03 | 0,26±0,04 |
| 1 сут | 0,29±0,03 | 0,24±0,04 | 0,28±0,05* | 0,23±0,03* | 0,13±0,05** | 0,29±0,02 | 0,3±0,07 |
| 7 сут | 0,3±0,03 | 0,26±0,06 | 0,23±0,04* | 0,24±0,05* | 0,16±0,04* | 0,28±0,03 | 0,28±0,04 |
| Ретинальная плотность биоэлектрического ответа компонента Р1, нВ/град2 | |||||||
| фон | 97,9±17,17 | 95,64±21,24 | 98,86±11,25 | 94,06±13,49 | 101,52±20,65 | 84,71±14,38 | 85,71±14,38 |
| 1 ч | 86,64±18,52 | 79,44±14,41 | 79,44±11,40* | 69,00±16,26* | 52,74±10,05* | 84,16±15,02 | 90,25±17,44 |
| 1 сут | 87,06±19,25 | 88,6±21,26 | 88,6±21,27 | 66,66±14,82* | 41,98±14,77* | 87,06±19,24 | 81,59±21,81 |
| 7 сут | 88,92±15,84 | 79,04±27,98 | 66,14±16,26* | 76,7±18,19* | 49,20±14,50* | 87,43±17,56 | 87,43±17,56 |
| Латентность N1, мс | |||||||
| фон | 23,08±1,25 | 23,28±3,1 | 21,1±1,96 | 21,46±2,06 | 21,11±2,16 | 22,94±1,55 | 23,52±1,69 |
| 1 ч | 22,08±1,72 | 23,62±3,11 | 21,8±1,48 | 21,82±1,81 | 23,66±2,08* | 21,68±1,78 | 21,97±1,94 |
| 1 сут | 21,98±1,4 | 23,94±2,65 | 20,82±1,58 | 21,44±1,45 | 24,8±2,44* | 22,43±1,49 | 22,75±2,33 |
| 7 сут | 23,7±1,08 | 23,48±2,69 | 21,12±1,72 | 21,6±2,9 | 20,42±2,04 | 23,12±1,51 | 23,15±1,38 |
| Латентность Р1, мс | |||||||
| фон | 43,92±1,36 | 42,34±3,69 | 42,42±2,85 | 42,42±1,95 | 42,94±2,98 | 42,96±2,37 | 43,18±2,53 |
| 1 ч | 42,16±1,72 | 42,5±3,65 | 43,04±1,78 | 44,98±1,47* | 44,12±1,93* | 42,15±1,87 | 42,94±1,38 |
| 1 сут | 43±1,35 | 43,28±3,88 | 45,24±1,71* | 45,44±1,74* | 47,56±2,14* | 42,77±2,08 | 43,31±2,6 |
| 7 сут | 43,74±1,58 | 41,46±3,55 | 42,4±1,74 | 45,28±2,11* | 46,06±2,13* | 43,18±1,95 | 42,55±1,64 |
| Латентность N2, мс | |||||||
| фон | 53,62±5,5 | 59,02±3,88 | 57,14±3,84 | 57,32±4,79 | 56,96±3,98 | 53,06±3,84 | 53,21±4,08 |
| 1 ч | 56,52±2,71 | 58,8±3,04 | 57,18±3,73 | 58,5±3,57 | 57,34±4,24 | 54,79±3,23 | 54,07±3,89 |
| 1 сут | 55,38±2,97 | 58,74±3,74 | 56,1±2,31 | 56,74±3,43 | 57,94±2,99 | 54,55±4,11 | 53,92±5,16 |
| 7 сут | 54,88±3,49 | 59,06±3,21 | 58,12±1,94 | 56,72±4,08 | 56,62±2,93 | 53,96±3,91 | 54,65±2,97 |
Примечание. * — p<0,05; ** — p<0,01 при сравнении со значениями фона (критерий Уилкоксона).
При энергии импульса 60 мВт офтальмоскопически видимое повреждение сетчатки занимало 25—32% площади соответствующего гексагона, при этом регистрация мфЭРГ выявила значимое снижение амплитуды пика Р1 при исследовании через 1 ч после воздействия (p=0,03; см. табл. 1). Тем не менее регистрируемые через 1 и 7 сут параметры мфЭРГ значимо не отличались от фоновых значений.
Повреждение сетчатки при мощности лазерного излучения в импульсе 100 мВт соответствовало 35—42% площади гексагона, при этом на регистрируемой мультифокальной электроретинограмме было отмечено значимое снижение амплитуды пика P1 через 1 ч, 1 и 7 сут после воздействия, а также показателя ретинальной плотности биоэлектрического ответа P1 через 1 ч и через 7 сут после воздействия и увеличение показателя латентности пика P1 через 1 сут после воздействия (p<0,05; см. табл. 1).
При воздействии импульсов с мощностью лазерного излучения 150 и 200 мВт формируемые ожоги по площади составляли до 50—55 и 95—110% площади гексагона в паттерне соответственно, а при мфЭРГ выявляли значимое снижение величины амплитуды и латентности пика P1 и ретинальной плотности биоэлектрического ответа компонента P1 через 1 ч, 1 и 7 сут после воздействия (p<0,05; см. табл. 1). Кроме того, наблюдалось значимое увеличение латентности пика N1 через 1 ч и 1 сут после воздействия импульса 200 мВт (p<0,05).
Анализ показателей латентности пика N2 в разные периоды регистрации мфЭРГ не выявил значимых изменений после воздействия импульсов лазерного излучения с различной энергией (см. табл. 1).
Корреляционный анализ показал, что между значениями амплитуды пика Р1 и значениями ретинальной плотности биоэлектрического ответа компонента Р1 и энергией импульса (и соответственно площадью лазерного повреждения) существует умеренная значимая обратная связь (0,52<r<0,71; p<0,01).
Анализ регистрируемых показателей в контроле 1 (нескольких гексагонах в паттерне, соответствующих интактным зонам сетчатки в глазах, подвергающихся лазерному воздействию; см. рис. 3, б—г), а также в контроле 2 (в соответствующих гексагонах паттерна в парных интактных глазах) не выявил значимых отличий на протяжении всего периода регистрации мфЭРГ (см. табл. 1).
Моделирование диффузного фототоксического повреждения сетчатки. Для моделирования диффузного фототоксического повреждения сетчатки, и в первую очередь центральных отделов, было проведено длительное повторяемое облучение источником интенсивного полихроматического света, при этом энергия воздействующего света на поверхности роговицы составляла 230 мкВт/см2, не превышая порогового уровня для развития термического повреждения тканей глазного дна.
При офтальмоскопическом исследовании через 7 сут после начала воздействия были отмечены признаки развития дегенеративных изменений сетчатки в форме перераспределения пигмента, ставшие более выраженными к сроку наблюдения 14 сут (рис. 4, а).
Рис. 4. Результаты мфЭРГ при моделировании диффузного фототоксического повреждения сетчатки.
а — глазное дно через 14 сут облучения: перераспределение пигмента (стрелки); б—г — результаты регистрации мультифокальной электроретинограммы до начала воздействия (фона), через 1 и 7 сут после начала светового воздействия соответственно.
В табл. 2 представлены результаты усредненного ответа по всей стимулируемой площади сетчатки. Регистрация мфЭРГ через 7 и 14 сут после начала воздействия показала, что в глазах, подвергавшихся световому воздействию, значимо изменились показатели амплитуды пика Р1 и показатели ретинальной плотности биоэлектрического ответа компонента P1 (p=0,03; см. табл. 2). Кроме того, при регистрации на 14-е сутки облучения выявлено значимое увеличение показателей латентности пиков N1 и P1 в сравнении как со значениями фона, так и с парными (интактными) глазами (см. табл. 2). Сравнение значений усредненных ответов по квадрантам и кольцам паттерна также выявило одинаковую динамику изменений биоэлектрической активности сетчатки.
Таблица 2. Результаты мфЭРГ при моделировании диффузного фототоксического повреждения сетчатки
| Группа (глаз) | Период наблюдения, сутки | |||
| фон | 1-е | 7-е | 14-е | |
| Амплитуда P1, мкВ | ||||
| Опыт (OD) | 0,17±0,02 | 0,18±0,01 | 0,12±0,03* † | 0,11±0,02* † |
| Контроль (OS) | 0,16±0,01 | 0,16±0,02 | 0,16±0,02 | 0,16±0,02 |
| Ретинальная плотность биоэлектрического ответа компонента Р1, нВ/град2 | ||||
| Опыт (OD) | 28,32±2,83 | 31,46±2,27 | 20,36±4,8* † | 15,08±1,87* † |
| Контроль (OS) | 28,02±2,61 | 28,32±2,83 | 27,66±3,12 | 27,82±2,52 |
| Латентность N1, мс | ||||
| Опыт (OD) | 23,48±0,73 | 23,9±1,92 | 24,36±1,47 | 26,53±1,94** † |
| Контроль (OS) | 23,36±0,66 | 22,92±1,01 | 23,24±0,99 | 23,08±1,28 |
| Латентность Р1, мс | ||||
| Опыт (OD) | 41,36±0,75 | 42,42±1,29 | 42,76±1,29 | 43,9±0,79** † |
| Контроль (OS) | 41,88±1,27 | 42,08±1,28 | 41,94±1,07 | 42,61±1,31 |
| Латентность N2, мс | ||||
| Опыт (OD) | 62,18±0,95 | 62,02±0,66 | 62,88±2,14 | 63±0,79 |
| Контроль (OS) | 62,26±0,99 | 62,38±0,78 | 60,86±1,19 | 62,4±1,3 |
Примечание. * — p<0,05; ** — p<0,01 при сравнении со значениями фона (критерий Уилкоксона); † — p<0,05 при сравнении со значениями парного глаза (контроль, критерий Манна—Уитни).
Вариабельность результатов регистрации мфЭРГ при обследовании животных в эксперименте. Результаты анализа вариабельности записи мфЭРГ представлены на рис. 5. Суммарно у животных, как в опыте с моделированием очаговой патологии, так и в опыте с моделированием диффузной патологии, значения амплитуды пика P1 на усредненной кривой варьировали на уровне 5% от среднего значения амплитуды, при этом сравнение результатов регистрации перед началом экспериментов и после завершения наблюдения (при очаговой патологии) или воздействия (при диффузной патологии) не выявило значимых колебаний как в глазах, подвергавшихся воздействию, так и в интактных глазах, служивших контролем.
Рис. 5. Степень отклонения (в %) результатов регистрации амплитуды пика P1 на усредненных кривых при трехкратном тестировании подвергавшихся воздействию (опыт) и интактных (контроль) глаз перед началом и после завершения экспериментов.
Данные представлены в формате медианы (точка), диапазона 25—75% (прямоугольник) и минимума-максимума (отрезок).
Обсуждение
Экспериментальное моделирование различных патологических процессов в органе зрения является неотъемлемой частью как фундаментальных исследований, так и отработки новых методов консервативного и хирургического лечения заболеваний органа зрения, при этом особенное внимание уделяется не только анатомическим, но и функциональным результатам лечения. Это определяет важность включения различных методов функциональной оценки в экспериментальные исследования на животных. Впервые разработанная в 1991 г., мфЭРГ к настоящему времени прочно закрепилась в клинической практике наряду с другими методами электрофизиологического и психофизического исследований [1, 3, 11]. Но в то же время при проведении экспериментальных работ (и особенно в отечественных работах) методу мфЭРГ не уделяется должного внимания, что может быть связано с отсутствием как соответствующего оборудования, так и условий или опыта выполнения этого исследования у животных.
В работе был использован относительно недавно разработанный отечественный комплекс для регистрации мфЭРГ — «Нейро-ЭРГ» («Нейрософт», Россия), при этом авторам пришлось частично адаптировать его для записи мфЭРГ у кроликов. Так, возникли трудности с контролем фиксации взора у животного и сопоставления проекции паттерна стимуляции с конкретной стимулируемой зоной сетчатки. В некоторых зарубежных системах блок стимулятора совмещен с инфракрасной камерой (например, в системе VERIS Science 6.4.1 фирмы «Electro-Diagnostic Imaging Inc.», США), что позволяет позиционировать и контролировать правильную зрительную фиксацию [7, 8]. В данном исследовании для решения этой проблемы животные весь период регистрации были в состоянии наркоза и оставались неподвижными, а перед исследуемым глазным яблоком в строго определенном положении (с соблюдением дистанций, углов наклона, параллельности плоскостей и соосности приборов) поочередно размещали фундус-камеру и монитор с паттерн-стимулятором. Подобное очевидное усложнение техники регистрации позволило более точно соотнести наблюдаемые изменения на глазном дне с соответствующими гексагонами паттерн-стимулятора, что было особенно заметно при проведении мфЭРГ на глазах с очаговой патологией.
Ранее было показано, что результаты регистрации мфЭРГ у человека могут варьировать с отклонениями амплитуды P1 в диапазоне 7—15%, а латентности — до 1,5% [12]. Для того чтобы определить, стабильны ли результаты записи при каждой регистрации мфЭРГ у одного и того же животного, до и после проведения экспериментов производили несколько повторных записей мфЭРГ и анализировали уровень отклонения результатов регистрации. При этом во всех группах полученное среднее отклонение в различные периоды тестирования составляло 4—6%, что позволяет говорить о достаточно стабильной воспроизводимости (повторяемости) результатов записи мфЭРГ и возможности дальнейшего применения используемого в работе комплекса при экспериментальных исследованиях на животных.
В данном исследовании в качестве биообъектов были использованы кролики, поскольку экспериментальные исследования витреоретинальной патологии офтальмологами наиболее часто выполняются на глазах кроликов ввиду удобства работы (сходные с глазом человека размеры глазного яблока и возможность клинического наблюдения без дополнительного специализированного оборудования) [13]. С другой стороны, сетчатка кролика имеет значимые отличия от сетчатки человека (мерангиотический тип сетчатки, отсутствие макулярной области, иное распределение фоторецепторов различных типов) [14, 15]. Тем не менее полученные в исследовании результаты согласуются с данными других работ [7—9] и демонстрируют возможность количественной оценки функциональных изменений на глазном дне в отдельных интересующих участках сетчатки (при изучении очаговых изменений) и в центральных отделах сетчатки в целом (при диффузных или мультифокальных изменениях).
Отдельного дальнейшего изучения может потребовать вопрос использования мфЭРГ как функционального метода при определении пороговых уровней воздействия различных факторов на сетчатку. Так, ранее в работе [9] было показано, что изменения при регистрации мфЭРГ становятся заметными при протяженности поврежденного участка 1 мм и более, хотя этот вывод был сделан авторами при исследовании результатов мфЭРГ сетчатки кролика с ретинэктомией участка 1 мм. В проведенном исследовании значимые изменения регистрировали при очаговом воздействии в случаях, когда диаметр зоны поражения составлял в среднем 170 мкм и она занимала не менее 35—42% площади соответствующего гексагона в паттерне стимуляции. В то же время, вероятно, выраженность локальных изменений, регистрируемых на мфЭРГ, зависит не только от площади повреждения, но и от распространенности поражения по глубине сетчатки, поскольку в формировании сигнала участвуют различные структуры сетчатки, распределенные по вертикали [11, 16]. Кроме того, проведение мфЭРГ с паттерн-стимулятором из большего количества ячеек (в работе использовали сетку из 61 гексагона), возможно, позволит обнаруживать меньшие по площади изменения сетчатки вследствие более высокого пространственного разрешения, но процедура регистрации при этом станет более трудоемкой и продолжительной по времени.
Ранее в экспериментальных исследованиях было определено, что среди компонентов мфЭРГ нисходящее колено пика N1 отражает гиперполяризацию off-биполяров и фоторецепторов, а восходящее колено пиков N1 и Р1 — деполяризацию on-биполяров и реполяризацию off-биполяров и фоторецепторов [16—18]. Таким образом, наибольший вклад в формирование мфЭРГ вносят биполярные клетки сетчатки, а вклад фоторецепторов в мфЭРГ более выражен в центральных отделах сетчатки (у человека). В данном исследовании среди анализируемых параметров наиболее заметные изменения происходили с пиком P1, что может свидетельствовать о повреждении не только наружных, но и внутренних слоев сетчатки. При моделировании очагового повреждения изменения в форме снижения амплитуды и ретинальной плотности ответа P1 при увеличении латентности являются следствием лазерного термического повреждения, и обнаруженная связь с энергией воздействия согласуется с характером вовлечения в повреждение ткани сетчатки по глубине: от пигментного эпителия сетчатки, являющегося акцептором лазерного излучения 0,532 мкм, к фоторецепторам и внутренним слоям сетчатки. Таким образом, можно предположить, что начало выявления изменений в мфЭРГ может свидетельствовать о пороговом повреждающем уровне воздействия на внутренние слои сетчатки.
Использованная модель диффузного фототоксического повреждения в общих чертах соответствует описанным ранее эффектам длительных высоких уровней воздействия света на сетчатку и подразумевает фотохимические механизмы повреждения [19]. Полученные результаты регистрации мфЭРГ при длительном воздействии света также согласуются с описанными ранее изменениями в сетчатке: вследствие того что клетки и ткань в целом подвергаются дегенеративным изменениям постепенно, значимые изменения в записи мфЭРГ становятся заметными после определенного уровня повреждения, вовлекающего в том числе и внутренние слои сетчатки. Полученные результаты указывают также на то, что применение мфЭРГ позволяет количественно оценивать динамику как локальных изменений, так и в пределах всей площади стимулируемого участка сетчатки при продолжительном многократном экспериментальном воздействии разного рода на орган зрения кролика.
Стоит отметить, что одним из недостатков использованного комплекса «Нейро-ЭРГ» явилось отсутствие в программном обеспечении возможности анализа амплитуды пика N1, что не позволило оценить динамику этого показателя при различных вариантах светового повреждения.
В работе были воспроизведены модели светового повреждения сетчатки, тем не менее можно предположить, что использованная техника регистрации мфЭРГ будет полезной при моделировании очаговой или диффузной патологии сетчатки кролика иной природы, например индуцированного воспаления, травматических повреждений, в том числе механических, лекарственных, токсических, радиационных эффектов, неблагоприятных производственных факторов, а также при оценке восстановления функции сетчатки на фоне проводимого лечения.
Заключение
Таким образом, применение систем регистрации мультифокальной электроретинограммы, в частности комплекса «Нейро-ЭРГ» («Нейрософт», Россия), может быть полезным при экспериментальных исследованиях витреоретинальной патологии при использовании в качестве биообъектов кроликов, поскольку выявленная корреляция между площадью повреждения, энергией воздействия и амплитудными характеристиками регистрируемого сигнала мфЭРГ указывает на возможность количественной оценки функциональных изменений в сетчатке лабораторных животных.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: А.С., С.А.
Сбор и обработка материала: С.А., А.С., М.О., А.К.
Статистическая обработка: А.С., А.К.
Написание текста: А.С., М.О.
Редактирование: С.А.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
<