Марченко Н.Р.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН, Москва

Каспарова Евг.А.

ФГБНУ «НИИ глазных болезней», ул. Россолимо, 11А, Москва, Россия, 119021

Диагностика акантамебного кератита

Журнал: Вестник офтальмологии. 2016;132(5): 103-109

Просмотров : 97

Загрузок : 3

Как цитировать

Марченко Н. Р., Каспарова Евг. А. Диагностика акантамебного кератита. Вестник офтальмологии. 2016;132(5):103-109. https://doi.org/10.17116/oftalma20161325103-109

Авторы:

Марченко Н.Р.

ФГБУ "НИИ глазных болезней" РАМН, Москва

Все авторы (2)

Уже почти 80 лет акантамебы (АА) известны протозоологам как сапрофитные организмы. Впервые культуру АА получили и описали А. Алексеев и В. Пушкарев соответственно в 1912 и 1913 гг. [1]. В 1930 г. Aldo Castellani описал амебу с морфологическими характеристиками, которые сейчас считаются характерными для АА [2]. Однако только во второй половине ХХ века стали накапливаться экспериментальные и клинические доказательства патогенности АА [3, 4].

Эти условно-патогенные простейшие широко распространены в природе. Они встречаются в почве, а также в водных источниках (пресных и соленых) и в питьевой воде [3]. Болезни, вызванные АА у людей, представлены акантамебным кератитом (AK), гранулематозным амебным энцефалитом, диссеминированной гранулематозной амебной болезнью, поражениями легких, кожи и других органов [3, 5]. Из 8 видов АА (Acantamoeba castellanii, Aс. polyphaga, Aс. cubertsoni, Aс. healyi, Aс. hatchetti, Aс. rhysodes, Aс. griffini и Aс. astronyxis) наиболее патогенными для тканей глаза являются Ac. castellani, Ac. culbertsoni, Ac. polyphaga, Ac. rhysodes, Ac. Hatchetti. Другие роды амебы (Hartmannella, Naegleria, Vahlkampfia) были выделены из роговицы при АК, хотя роль этих организмов в развитии АК не доказана [6].

АА в своем жизненном цикле имеет две морфологические формы — трофозоит и цисту. Обе стадии могут быть найдены как в тканях больных, так и во внешней среде. Трофозоит — делящаяся форма, и, предположительно, только он обладает способностью к инвазии. Он питается одноклеточными водорослями, бактериями и другими простейшими. При инвазии в роговицу трофозоит АА начинает питаться кератоцитами. Размножается возбудитель делением на две части. Цисты — бездействующие и защищенные от вредных сред формы паразита. Они достаточно устойчивы к биоцидам, хлорированию и антибиотикам за счет внешней хитиновой оболочки. Трофозоиты имеют размер от 25 до 50 мкм, а цисты — 15—30 мкм, поэтому легко обнаруживаются при световой микроскопии [7, 8].

АК — наиболее распространенная форма акантамебных поражений с заболеваемостью около 0,15 (варьирует от 0,1 до 0,4) случаев на 1 млн населения, является одним из самых опасных заболеваний роговицы [9, 10]. Гранулематозный амебный энцефалит чаще наблюдается у пациентов с нарушением иммунного статуса, в то время как АК, как правило, возникает у клинически здоровых людей [5].

Первый случай АК представлен D. Jones и соавт. в 1973 г. [5]. Впоследствии были описаны клинические факторы риска — ношение контактных линз (КЛ) (в развитых странах) или травма и контакт с загрязненной водой, а также ослабление иммунитета (в развивающихся странах) [11—14]. В некоторых работах описаны источники возникновения АК: в одной — у пациента с рецидивирующей эрозией роговицы, возникшей после плавания в пруду, во второй — после травмы роговицы мелкой металлической стружкой, в третьей — после попадания в глаз воды из загрязненного водоема. Есть сообщение о выделении Acanthamoeba polyphaga у 74-летней пациентки после сквозной кератопластики, выполненной по поводу буллезной кератопатии. Авторы обсуждали возможность инвазии акантамебой роговичного трансплантата после кератопластики [15].

Впервые клинически диагностированный и культурально подтвержденный случай АК в России был описан проф. В.В. Волковым в 1993 г. [16]. И.Н. Околов разработал первую отечественную технологию идентификации АА методом биокультивирования [17]. В отечественной литературе последних лет имеются отдельные публикации, посвященные АК [17—20].

АК приобрел клиническое значение в 80-х годах ХХ века, когда М. Moore и соавторы связали резкое увеличение количества случаев АК с ношением КЛ [21, 22]. К 1989 г. в США было зарегистрировано около 300 больных АК, причем в 85% случаев связь заболевания с ношением КЛ не вызывала сомнения [11]. В Новой Зеландии первый случай АК был описан в 1999 г. и еще 7 случаев — до конца 1996 г. В то же время в 1990 г. S. Sharma и соавт. [13] описали 9 случаев АК в Индии у пациентов, никогда не носивших КЛ.

Среди причин, приводящих к повышению риска возникновения АК, многие авторы выделяют пролонгированный режим ношения КЛ и нарушение правил ухода за ними. Потенциальным источником инфекции являются загрязненные контейнеры для КЛ [24]. При обследовании в течение 4 лет у 243 больных АК выделены следующие основные причины, способствующие возникновению заболевания: нарушение режима очистки линз (62%), плавание с КЛ (34%), нарушение стерильности раствора по уходу за линзами (8%) [25].

В 1998 г. P. Simmons и соавторы выявили более интенсивную адсорбцию АА на КЛ из ионных материалов с большим содержанием воды. Исходя из этого, авторы считают, что риск развития АК у лиц, носящих КЛ, может быть уменьшен за счет выбора линз с меньшим содержанием воды, изготовленных из неионных материалов [26]. Акантамебы в форме трофозоитов и цист способны фиксироваться на поверхности как мягких, так и жестких КЛ [27].

С точки зрения большой частоты возникновения АК у пациентов, использующих КЛ, можно выделить 4 основных фактора:

1) гипоксия роговицы на фоне ношения КЛ;

2) микроповреждения эпителиального слоя;

3) нарушение целостности слезной пленки;

4) длительное нахождение возбудителя под КЛ [18].

Внедрение в клиническую практику ортокератологии способствовало возникновению АК и у этой группы пациентов. Поскольку ортокератологическая КЛ имеет обратный профиль, создает значительное механическое давление на роговицу, а также используется ночью, стоит ожидать повышение риска инфекционных кератитов. К настоящему времени описаны многочисленные случаи АК после применения ортокератологических КЛ [28, 29]. В случае развития кератита при использовании ортокератологических КЛ частота АК составила 37,5—50% [28].

Патогенез АК

Хотя повреждения роговичного эпителия не являются обязательным условием для инвазии АА, эрозия роговицы или повреждение эпителия при гипоксии, связанной с ношением КЛ, очевидно, способствует развитию кератита [30]. Трофозоиты и цисты адгезируются к поверхности роговицы и скапливаются в межэпителиальном пространстве. В начальных стадиях они обнаруживаются в самых поверхностных отделах стромы роговицы с незначительной воспалительной клеточной инфильтрацией. Даже в случаях колонизации трофозоитами и цистами всей толщи роговицы воспалительная инфильтрация формируется первоначально только в поверхностных слоях [31].

Сопутствующая бактериальная инфекция при АК обнаруживается довольно часто, по некоторым данным, — у 58% больных [32]. Предполагается, что бактерии повышают патогенность АА, так как служат источником питательного материала до тех пор пока некроз стромы не приведет к освобождению других источников питания для амеб [19].

Патогенные штаммы АК продуцируют множество протеаз, включая акантамебный активатор плазминогена, который облегчает проникновение паразита в роговичную ткань [33]. Дальнейший процесс включает набухание и деструкцию коллагена, гибель кератоцитов вследствие апоптоза, ферментативного лизиса, обусловленного протеазами амебы и активацией протеаз хозяина, токсического действия продуктов цитолиза и иммунных реакций [31, 34]. Ранний диагноз очень важен при AK, поскольку заболевание обычно развивается быстро, и отсутствие адекватной терапии в течение 3 нед и более считается прогностически неблагоприятным [14]. Oднако в отдельных случаях АК прогрессирует очень медленно (иногда в течение нескольких месяцев). Подобное малосимптомное течение заболевания также влечет позднюю диагностику и может приводить к значительным морфологическим и функциональным изменениям глаза [35].

Клинические признаки АК

АК можно заподозрить на основании анамнестических и клинических данных. Анамнестическими факторами считаются: 1) ношение любых КЛ; 2) незначительная роговичная травма, сочетающаяся с загрязнением раны почвой или попаданием воды (природной или водопроводной) [36].

По данным Ю.Ф. Майчука [19], отдельные симптомы АК распределяются следующим образом: эпителиальный кератит — 65%, эпителиопатия, микроэрозии, точечный кератит — 42%, эпителиальные поражения с кольцевой инфильтрацией — 15%, эпителиальные поражения с инфильтрацией стромы некольцевой формы — 8%, стромальный кератит — 35%, стромальный кератит без поражения эпителия — 6%, стромальный кератит с дефектом эпителия — 16%, некротизирующая язва роговицы — 4%, кератосклерит — 9%.

Вероятно, склерит является иммунной реакцией на очаг инфекции в роговице. По крайней мере, подтвержденного обнаружения возбудителя в склеральных очагах не имеется, хотя частота склерита составляет от 10 до 42% в зависимости от выраженности кератита [34].

Другими симптомами, обнаруживаемыми при АК, являются: повышенная чувствительность роговицы, роговичный синдром — 25%, кератоневрит — 5%, новообразованные сосуды роговицы — 2%, отек век — 13%, птоз — 9%, ирит — 35%, повышение внутриглазного давления (ВГД) — 22%, понижение ВГД — 2%, нормальное ВГД — 76% [19].

Другими исследователями отмечены: 1) сильная боль; 2) инфильтративный стромальный кератит с очагом сероватого цвета (кольцевой инфильтрат в более чем половине случаев); 3) радиальные, в виде лучей, стромальные инфильтраты по ходу нервных волокон — кератоневрит; 4) увеит (возможен гипопион); 5) эпителиальная эрозия или язва; 6) диффузный или узловой склерит; 7) отрицательные результаты попыток обнаружения бактерий, грибов и вирусов; 8) хроническое прогрессирующее течение инфекции и недостаточная эффективность антимикробных и противовирусных средств [37, 38].

АК часто ошибочно расценивается как герпетический кератит (ГК), поскольку наблюдаются умеренно выраженная инъекция глазного яблока (чаще перикорнеальная) и наличие точечных и субэпителиальных инфильтратов, которые, сливаясь, могут образовывать фигуру, напоминающую «веточки дерева» (так называемый псевдодревовидный кератит) [14, 37]. Воспалительный процесс постепенно прогрессирует по глубине и площади роговицы, появляются стромальные изменения и формируются кольцевые инфильтраты белесоватого-серого или белого цвета. Наличие инфильтрата в виде кольца или полукольца является патогномоничным признаком АК [37]. При прогрессировании кератита возможны образование глубоких язв роговицы вследствие действия протеаз, выделяемых АА, формирование десцеметоцеле и перфорация роговицы.

Характерным симптомом АК являются чрезмерно сильные, порой неадекватные клиническим проявлениям, боли в пораженном глазу в связи с амебной инвазией в нервы роговицы, приводящей к кератоневриту [21]. Часто А.К. сопровождаются склеритами и осложняются офтальмогипертензией [34, 37].

В отличие от ГК, который также часто провоцируется незначительной травмой, условием для развития АК является ассоциация травмы и контакта с почвой или водой. Ношение К.Л. редко предшествовало ГК, в то время как подавляющее большинство случаев АК ассоциируется с КЛ [11]. Выраженность боли при АК, как правило, выше, чем при ГК [21]. Кроме того, кольцевидный (овальный) инфильтрат, образующийся в развитой стадии АК, который расценивается как ведущий симптом АК, редко отмечается при стромальном ГК [37].

Другим заболеванием, часто принимаемым за амебную инвазию, является кератомикоз. Стромальный кератит, белесоватый цвет инфильтрата, травма с загрязнением органическими материалами и хроническое течение делают разграничение грибкового кератита и АК очень трудным клинически. Однако сильная боль и кольцевой инфильтрат, более характерные для амебной инфекции, могут помочь клиническому дифференцированию [39].

Клиническая картина кератита, вызванного микобактериями, тоже может быть сходна с А.К. Так как в значительном большинстве случаев эти поражения также связаны с травмой, сочетаемой с загрязнением почвой, стоит учитывать и эту причину. В целом комбинация клинических признаков в виде чрезмерных болевых ощущений и стромального кольцевого инфильтрата вместе с некоторыми деталями анамнеза (ношение КЛ, контакт с загрязненной водой) является важным фактором для ранней правильной диагностики, что в ряде случаев позволяет избежать кератопластики [39].

Тем не менее до настоящего времени вероятность диагностических ошибок при клинической диагностике АК остается слишком высокой — 22—25% [14, 37].

Морфологическая диагностика АК

AK может быть достоверно диагностирован, если при исследовании роговичного биоптата и роговичных дисков обнаруживают трофозоиты или цисты. Биопсия роговицы имеет большую ценность вследствие быстроты получения результатов и не требует специальных инструментов [40, 41]. После местной анестезии, под контролем биомикроскопии стерильным хирургическим лезвием выполняется выскабливание со дна и краев язвы. Препарат помещают на предметное стекло, окрашивают по Киньону, Гимзе либо гематоксилином и эозином и проводят световую микроскопию. Относительно легко выявляются цисты, тогда как трофозоиты обнаружить труднее, потому что они могут напоминать воспалительно-измененные собственные клетки роговицы. Специфическим окрашиванием для АА является калькофлюор белый, который прокрашивает полисахариды, входящие в состав оболочки цист. Идентификация возбудителя в данном случае проводится с применением флюоресцентной микроскопии. Трудности могут возникать в дифференцировании АК и грибкового кератита, так как калькофлюор белый окрашивает и клеточную стенку грибов [41]. Возможно использование и других флюоресцирующих окрасок, в частности — акридинового оранжевого [42]. Трансмиссивная электронная микроскопия позволяет достаточно четко дифференцировать цисты и трофозоиты АК [43].

Культуральная диагностика

Самым доступным методом культивирования АК является биокультура — выращивание ее на предварительно подготовленной культуре E. coli на голодном (1,5%) агаре. Каждые 24 ч проводится осмотр культуры с помощью инвертированного микроскопа. Сначала начинается гибель бактерий, а в последствии амебы образуют хорошо различимые цисты — культура инцистируется. В России эта методика успешно применена И.Н. Околовым, вместо E. coli возможно использование Enterococcus faecalis [17]. Метод неплохо дополняет морфологическое исследование. Так, в 74% случаев АК положительны результаты культурального и морфологического тестов, а каждого в отдельности — даже в 87,2% случаев. Возможно также использование биокультуры для тестирования лекарственных средств и типирования возбудителя для получения эпидемиологической информации [17, 44].

Иммунохимическая диагностика

Сложность серодиагностики АК состоит в том, что, поскольку возбудитель распространен повсеместно, антитела к АА встречаются более чем у 50% здоровых людей. В отдельных исследованиях, однако, было показано повышение уровня IgG к АА и, напротив, снижение IgA [45]. В перспективе возможна разработка селективных серологических маркеров АА.

Иммунохимическое обнаружение возбудителя в пораженной ткани возможно несколькими методами. Непрямой метод флюоресцирующих антител (1- й этап — связывание антигена с кроличьей сывороткой к Аc. castellani, Аc. polyphaga и Аc. culbertsoni; 2-й этап — реакция этого комплекса с флюоресцирующими антителами козы к кроличьим иммуноглобулинам) позволил не только выявлять трофозоиты и цисты АА, но и идентифицировать вид возбудителя — Аc. culbertsoni [39], что в дальнейшем было подтверждено серологически. R.J. Epstein успешно диагностировал с помощью этой же методики 2 случая АК, но в одном была получена ложноположительная реакция на АА у пациента с герпесвирусным кератитом [46]. Вместо иммунофлюоресценции возможно применение иммунопероксидазной реакции. В исследовании S. Sharma этот тест показал 100% чувствительность и 94% специфичность [47]. Авторы особо отметили простоту его выполнения.

Генная диагностика

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — важный и ценный метод для раннего диагноза АК, он пригоден и для идентификации разновидностей АА. В настоящее время обычно используемые молекулярные маркеры включают 18 rРНК и 26 rРНК.

Чувствительность и специфичность ПЦР пока оцениваются несколько ниже культурального и морфологического исследований [48].

Использование количественной ПЦР в реальном времени может избавить от необходимости гель-электрофореза и сократить трудоемкость обработки, а также повысить чувствительность более 89,3% [49]. Определенную сложность представляет разграничение АА — возбудителя АК от патогенных свободно живущих и непатогенных штаммов, которые имеют сходные генетические характеристики. М. Kandori и соавт. [50] разработали мультиплексный qПЦР-метод, чтобы обнаружить различные роды А.А. Этот метод, как оказалось, был точным, надежным и чувствительным; мог использоваться для определения единственной цисты. Чувствительность этого метода составляла до 81%. Дальнейшее совершенствование этой техники ПЦР направлено на получение и более высокой чувствительности. Р. Laummaunwai и соавт. [51] создали технологию извлечения ДНК, позволяющую выделять жизнеспособную ДНК из единичных цист А.А. Ранее невозможность извлечения ДНК из цист считалась серьезным недостатком техники ПЦР.

Описаны случаи АК с отсутствием морфологических признаков этого заболевания и отрицательными результатами культивирования инфекционных возбудителей. Однако ПЦР в реальном времени обнаружила ДНК АА [51].

Эти успехи демонстрируют, что ПЦР реального времени становится эффективной диагностической техникой, которая значительно быстрее выполнима, чем культивирование АА, и не требует проведения биопсии. Поэтому ПЦР в реальном времени может быть осуществлена ранее и шире применяться.

Прижизненная микроскопия роговицы

Прижизненная конфокальная микроскопия (КМ) роговицы позволяет проводить микроструктурный анализ роговицы в естественных условиях, получая высококонтрастные изображения слоев роговицы. Увеличения приблизительно от 240 до 400° достаточно, чтобы визуализировать и идентифицировать нормальные роговичные клеточные компоненты и посторонние клетки [52]. К. Winchester и соавт. [53] применили КМ для обследования 10 пациентов с AK в 1995 г. Результаты показали, что цисты АК, выглядящие как гиперрефлексивные, круглые структуры с двойными стенками с диаметром от 10 до 30 µm, наблюдались во всех случаях подтвержденного А.К. Как подчеркивает Н. Kaufman, КМ ярко выявляет и другой важный диагностический признак АК — кератоневрит, утолщенные нервные стволы и белые линии вдоль нервов как реакцию на нейротропность амеб [21]. Однако визуализация с высоким разрешением может быть затруднена из-за световых рефлексов, особенно при нарушении прозрачности роговицы [54]. Исследование имеет высокую чувствительность (92,9—100%) и специфичность (77,3—100%), но требует высокой квалификации оператора [55].

Гейдельбергская томография сетчатки (HRTII) может быть использована и для получения изображений роговицы. Т. Bourcier и соавт. [56] смогли обнаружить многочисленные круглые частицы (диаметр 20—26 мкм) в роговичном эпителии и поверхностной строме, расценив их как цисты А.А. Это исследование также показывало звездообразные и яйцевидные клетки, которые, возможно, были клетками воспалительного инфильтрата, трофозоитами, измененными цистами или активированными кератоцитами в области стромальных инфильтратов. При дальнейшем совершенствовании эта методика может быть полезной в диагностике и мониторинге АК.

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) недавно была использована in vitro для обнаружения АА [57]. Биохимические характеристики различных штаммов организма, определяемые ЯМР, могут обеспечить высокий уровень чувствительности и специфичности, сравнимый с таковыми при ПЦР. Перспективы этого исследования остаются пока неясными, но оно может дать выигрыш в точности, скорости и цене по сравнению с ПЦР.

Заключение

Как и при многих других заболеваниях роговицы, ранняя постановка диагноза и своевременно начатое адекватное лечение АК оказывают решающее влияние на его исход и дальнейший прогноз. Ранние (эпителиальные) формы АК излечиваются довольно успешно, тогда как развитые (стромальные) формы АК трудноизлечимы и чреваты серьезными осложнениями (прогрессирующая язва и лизис роговицы, перфорация роговицы, иридоциклит, склерит, вторичная глаукома, присоединение вторичной бактериальной/грибковой инфекции).

По данным обзора литературы выявлены основные анамнестические и диагностические признаки АК: 1) ношение КЛ; 2) промывание глаза загрязненной или водопроводной водой; 3) травма роговицы частицами земли и/или пыли.

Основными клиническими признаками, позволяющими заподозрить АК, являются:

1. Выраженные боли, неадекватные поражению роговицы.

2. Кератоневриты в виде лучистых стромальных инфильтратов роговицы.

3. Кольцевидный (как правило, овальный, горизонтально «растянутый») стромальный инфильтрат роговицы.

4. Резистентность к лечению антибиотиками и противогерпетическими препаратами.

Инструментальная диагностика АК сложна и трудоемка. В настоящее время среди исследователей нет единодушия о ведущем методе диагностики А.К. Отмечаются случаи кератита со всеми клиническими и анамнестическими признаками АК, но с противоречивыми и даже полностью негативными инструментальными данными.

Офтальмологам следует соблюдать особую настороженность в отношении любых кератитов, развившихся у пациентов, применяющих К.Л. Лица, применяющие КЛ, должны быть проинформированы офтальмологами и контактологами о рисках развития А.К. Особый риск развития АК связан с ортокератологическими процедурами.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail