Сравнительный анализ влияния различных вариантов кросслинкинга на биохимическую стабильность роговицы

Кератоконус (КК) — дегенеративное невоспалительное заболевание роговицы, характеризующееся прогрессирующим асимметричным истончением роговицы с выпячиванием ее центральных отделов и снижением остроты зрения, приводящее к инвалидизации больных в молодом, работоспособном возрасте [1—4]. Патогенетически обоснованным методом лечения прогрессирующего КК является кросслинкинг роговичного коллагена (КРК), при котором происходит повышение биомеханических свойств роговицы за счет образования ковалентных связей между волокнами коллагена в строме роговицы, возникающее в результате комбинированного воздействия фотосенсибилизирующего вещества (рибофлавина, или витамина В2) и ультрафиолетового света [5—7]. Стандартная методика КРК заключается в удалении роговичного эпителия (с помощью шпателя либо метода фоторефракционной кератэктомии), насыщении стромы 0,1% раствором рибофлавина с последующим ультрафиолетовым облучением в течение 30 мин [8—13]. В связи с дефектом эпителия в раннем послеоперационном периоде пациенты предъявляют жалобы, характерные для роговичного синдрома, также возможны осложнения в виде кератита, рубцов роговицы [14, 15]. В связи с этим в последние годы большой интерес представляют методы локального КРК без удаления эпителия с формированием интрастромального кармана для введения 0,1% раствора рибофлавина и локальным ультрафиолетовым облучением в месте истончения роговицы, а также комбинированные методики имплантации кольца MyoRing или роговичных сегментов с КРК, что может быть альтернативой существующему стандартному методу [1, 16—26].

Цель работы — сравнительный анализ влияния стандартного КРК (СКРК), локального трансэпителиального фемтокросслинкинга (ЛТФ) и трансэпителиального интрастромального фемтокросслинкинга с имплантацией кольца MyoRing (ТИФ+MyoRing) на биомеханическую стабильность роговицы в эксперименте и на основе клинико-морфологических результатов у пациентов с прогрессирующим КК II и III стадии.

Для экспериментальной работы использовали 10 кроликов-самцов (20 глаз) породы Шиншилла массой 2—3 кг. Исследования выполняли под общей (5% раствор кетамина внутривенно) и местной (инстилляция 0,3% раствора инокаина) анестезией (рис. 1, а). Животные были разделены на 4 группы по 5 глаз в каждой: 1-я группа — контроль, 2-я —глаза после СКРК, 3-я — после ЛТФ, 4-я — после ТИФ+MyoRing. Срок наблюдения составил 1 мес.

Группу контроля составили кролики с прозрачными, интактными роговицами. Животным 2-й группы производили механическое удаление эпителия роговицы диаметром 9 мм, затем инстилляцию 0,1% раствора рибофлавина в течение 15 мин. Облучение роговицы ультрафиолетом (3 мВт/см² в течение 30 мин) осуществляли с помощью аппарата EVOLUTION (ООО «Трансконтакт», Россия) (см. рис. 1, б, в). Животным 3-й группы выполняли процедуру фемтокросслинкинга с помощью фемтосекундного лазера (ФСЛ) IntraLaseFS 60 кГц («Advanced Medical Optics») (см. рис. 1, г). Для этого на заданной глубине (100—110 мкм) формировали карман с внутренним диаметром 4 мм, внешним — 9 мм и радиальным входным разрезом длиной 2 мм. В сформированный таким образом карман с помощью тупоконечной канюли вводили 0,1% раствор рибофлавина до полного и равномерного пропитывания стромы. Затем проводили облучение ультрафиолетовым светом при стандартных параметрах в течение 30 мин. Животным 4-й группы сначала сформировали интрастромальный карман диаметром 9 мм на глубине 300 мкм с помощью ФСЛ IntraLaseFS 60 кГц, затем в него с помощью тупоконечной канюли вводили 0,1% раствор рибофлавина до полного и равномерного пропитывания стромы с последующим облучением ее ультрафиолетовым светом при стандартных параметрах в течение 15 мин.

На сроке 1 мес кроликов выводили из эксперимента воздушной эмболией, глаза энуклеировали. Для исследования биомеханических свойств роговицы изучали способность к растяжению образцов роговицы экспериментальных животных, подвергшихся процедуре КРК и фемтолазерного формирования интрастромального кармана. Выкраиваемые полоски ткани размером 12×20 мм захватывали весь диаметр роговицы и часть склеры для закрепления между лапками универсальной испытательной машины ZWICK/ROELL Z005 на расстоянии 10 мм (рис. 2, 3). Натяжение повышалось линейно со скоростью 50 мм/мин до разрыва ткани. Полученные численные результаты фиксировались программным управлением испытательной машины.

В клинике нами были прооперированы 48 пациентов (45 глаз) с КК II и III стадии (по классификации Amsler, 1961 г.). Всем пациентам операции выполняли при прогрессирующем КК II и III стадии, при прозрачной центральной зоне роговицы, минимальном значении пахиметрии — более 400 мкм. Критериями прогрессирования КК являлись (по отношению к данным за последний год наблюдения): серия кератотопограмм, указывающих на увеличение максимального значения кератометрии (Kmax) на 1 и более диоптрий, увеличение астигматизма на 1 и более диоптрий, ухудшение корригированной остроты зрения на 2 строки и более. В зависимости от метода операции все пациенты были разделены на 3 группы. В 1-й группе 9 пациентам (14 глаз) была выполнена ТИФ+MyoRing («Dioptex», Австрия) в два этапа: I этап — имплантация кольца MyoRing в заранее сформированный с помощью ФСЛ IntraLase FS 60 kHz («AMO», США) интрастромальный карман диаметром 9 мм, выполненный на глубине 80% толщины роговицы; во всех случаях использовали энергию импульса 1,8 мк Дж, расстояние между импульсами 4 мкм, между уровнями — 4 мкм; II этап — ТИФ, заключающийся во введении в интрастромальный карман 0,1% раствора рибофлавина до полного пропитывания стромы с последующим облучением ультрафиолетовым светом (длина волны 376—375 нм) с плотностью мощности 3 мВт/см² на аппарате Evolution (ООО «Трансконтакт», Москва) с расстояния 10 см от поверхности роговицы в течение 15 мин.

Во 2-й группе 20 пациентам (16 глаз) была выполнена процедура СКРК, которая включала в себя удаление роговичного эпителия диаметром 9 мм с помощью шпателя с последующей инстилляцией 0,1% раствора рибофлавина в течение 15 мин, затем облучение ультрафиолетовым светом длиной волны 375—376 нм и плотностью мощности 3 мВт/см² в течение 30 мин.

В 3-й группе 19 пациентам (15 глаз) процедура ЛТФ была выполнена в два этапа: I этап — кератотопографически ориентированное формирование с помощью ФСЛ IntraLase FS интрастромального тоннеля, проходящего через вершину кератэктазии на глубине (от 150—190 мкм) с внутренним диаметром 4 мм, внешним — 9 мм и радиальным входным разрезом длиной 2 мм; во всех случаях использовали энергию импульса 1,8 мк Дж, расстояние между импульсами 4 мкм, между уровнями — 4 мкм; II этап — в сформированный интрастромальный тоннель вводили 0,1% раствор рибофлавина до полного пропитывания стромы с последующим локальным облучением ультрафиолетовым светом (длина волны 376—375 нм) с плотностью мощности 3 мВт/см² с расстояния 10 см в течение 30 мин.

До и через 3 и 6 мес после операций проводили анализ вязко-эластических свойств роговицы на оптическом анализаторе биомеханических свойств роговицы ORA («Reichert», США) и конфокальную биомикроскопию с подсчетом плотности эндотелиальных клеток (ПЭК) на конфокальном микроскопе Confoscan-4 («Nidek», Япония).

Срок наблюдения в среднем составил 6 мес (от 3 до 9 мес).

Статистическую обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере с использованием статистической программы Statistica 6.1 (программный продукт «StatSoft», США). В связи c нормальным распределением значений показателей использовали число наблюдений (n), среднее значение (М), стандартное отклонение (SD). Достоверность различий оценивали по параметрическим критериям Стьюдента (р<0,05). Для определения степени зависимости между изучаемыми показателями и ее направленности проводили корреляционный анализ.

В ходе проведения экспериментальной работы мы получили следующие результаты: в группе контроля сила, необходимая для разрыва роговичного образца, составляла 3,6±0,27 МРа (р=0,0213); во 2-й группе через 1 мес после СКРК предельное напряжение, при котором наступал разрыв роговичного образца, повысилось на 77,8% (р=0,0413), в 3-й группе — на 69,4% (р=0,0338), в 4-й — на 63,9% (р=0,0447) (табл. 1). Таким образом, эксперимент показал значительное увеличение силы, необходимой для разрыва роговичных образцов, подвергшихся процедурам трансэпителиального фемтокросслинкинга в 3-й и 4-й группах и СКРК во 2-й группе. В то же время само по себе фемтолазерное формирование интрастромального кармана не вызвало статистически значимого снижения биомеханической прочности роговичной ткани.

При проведении операций в клинике у пациентов с прогрессирующим КК интра- и послеоперационных осложнений не было. Ранний послеоперационный период у больных 1-й и 3-й групп протекал ареактивно. Во 2-й группе у всех пациентов присутствовал роговичный синдром в первые 3—4 дня после операции в связи с деэпителизацией роговичной поверхности, что требовало наложения на нее контактной линзы. Биомикроскопически визуализировался псевдохейз у пациентов 1-й и 3-й групп в области интрастромальных тоннелей и карманов, у пациентов 2-й группы — в передних слоях стромы (рис. 4, a—в). У некоторых пациентов определялись локальные субконъюнктивальные кровоизлияния вследствие наложения вакуумного кольца, кольца MyoRing были центрированы, согласно данным кератотопограмм.

В 1-й группе при оценке вязкоэластических свойств роговицы на аппарате ORA через 3 мес после операции было отмечено увеличение фактора резистентности роговицы (ФРР) на 0,5±0,18 мм рт. ст (р=0,0222), корнеального гистерезиса (КГ) — на 0,3±0,1 мм рт. ст (р=0,0564) (табл. 2). К 6 мес после операции ФРР повысился еще на 0,5±0,12 мм рт. ст (р=0,0418), КГ — на 0,7±0,15 мм рт.ст. (р=0,0327). Во 2-й группе через 3 мес после операции ФРР увеличился на 0,4±0,11 мм рт.ст. (р=0,0252), КГ — на 0,3±0,06 мм рт.ст. (р=0,0351). К 6 мес после операции ФРР повысился на 0,4±0,27 мм рт.ст. (р=0,0023), КГ — на 0,2±0,08 мм рт.ст. (р=0,0445). В 3-й группе через 3 мес после операции ФРР увеличился на 0,4±0,05 мм рт.ст. (р=0,0412), КГ — на 0,2±0,1 мм рт.ст. (р=0,0323). К 6 мес после операции ФРР повысился на 0,4±0,29 мм рт.ст. (р=0,0055), КГ — на 0,4±0,23 мм рт.ст. (р=0,0491). Во всех трех группах не было отмечено в течение всего периода наблюдения статистически значимого снижения ПЭК.

При конфокальной микроскопии во всех трех группах в раннем послеоперационном периоде в месте облучения наблюдалось уплотнение коллагеновых волокон (рис. 5, а), скопление гиперрефлексирующих кератоцитов (см. рис. 5, б). Морфологических признаков повреждения эндотелиального слоя выявлено не было. У пациентов 1-й группы через 3 мес после ТИФ+MyoRing в области интрастромального кармана визуализировалась умеренно выраженная складчатость и гипоцеллюлярность (рис. 6, a), наблюдались в незначительном количестве гиперрефлексирующие включения (см. рис. 6, б) различной формы и величины, утолщенные стромальные нервы (см. рис. 6, в). В области входного роговичного тоннеля заживление стромы произошло с формированием эпителиальной пробки, но ни одного врастания эпителия в интрастромальный карман отмечено не было (см. рис. 6, г). Интактная прилежащая строма не была изменена. Через 6 мес после операции происходили процессы ремоделирования роговицы, что проявлялось уменьшением выраженности складок (рис. 7, a), активных кератоцитов (см. рис. 7, б), восстанавливалась толщина стромального нерва (см. рис. 7, в). В прилежащей к карману строме прозрачность восстановилась, кератоциты четко дифференцировались, наблюдались единичные гиперрефлексирующие включения (см. рис. 7, г). Субэпителиальные нервы визуализировались без изменений. У пациентов 2-й группы после СКРК была выявлена уплотненная боуменовая мембрана с линейными гипер- и гипорефлексирующими включениями (рис. 8). У пациентов 1-й и 3-й групп после операции изменений в боуменовой мембране выявлено не было.

1. Проведенное нами экспериментальное исследование показало, что ЛТФ, ТИФ и СКРК в равной степени увеличивают биомеханическую прочность роговицы, что может свидетельствовать об одинаковой эффективности методик. Фемтолазерное формирование интрастромального кармана не вызывает статистически значимого ухудшения биомеханической стабильности роговицы.

2. Комбинированная операция ТИФ+MyoRing у пациентов с прогрессирующим КК II и III стадии при сроке наблюдения 6 мес демонстрирует более высокую биомеханическую стабильность роговицы за счет сочетания механического и химического методов ее укрепления.

3. Все три метода являются безопасными, а использование фемтосекундного лазера позволяет выполнить операции технически проще и быстрее, сделать ранний послеоперационный период безболезненным. Необходимо дальнейшее наблюдение за пациентами в позднем послеоперационном периоде для оценки стабильности и предсказуемости результатов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: М. С, В.З.

Сбор и обработка материала: М. С, В.З., Б.Г.

Статистическая обработка: М. С, В.З.

Написание текста: М. С, В.З.

Редактирование: Н.П.П., Н.А.П.

Конфликт интересов отсутствует.