Применение наноструктурированного биопластического материала при травматических повреждениях роговицы

По данным исследований, в Российской Федерации насчитывается более 500 тыс. слепых и слабовидящих, из них до 18% приходится на пациентов с патологией роговицы [1].

Этиопатогенетические факторы, приводящие к нарушению целостности и прозрачности роговой оболочки, весьма разнообразны: травмы и ожоги, воспалительные заболевания и дистрофии. Данные заболевания нередко приводят к формированию бельма, т. е. к замещению структуры роговицы грубой волокнистой соединительной тканью с новообразованными сосудами [2—5]. В качестве временного покрытия, являющегося протектором восстановления ткани роговицы, используют консервированную донорскую роговицу, но в связи с трудностями с забором кадаверной роговицы прибегают к использованию различных видов биологических покрытий: конъюнктивы, трансплантатов из твердой мозговой оболочки, склеры, амниотической мембраны, аллопланта [6—8]. Однако применение каждого из указанных материалов не лишено недостатков. Это связано с нанесением дополнительной хирургической травмы при заборе материала, ограниченным количеством доступной ткани, а в случаях аллопластики — с возможной тканевой несовместимостью, вследствие чего все большее предпочтение отдается синтетическим материалам [9].

В научно-производственной лаборатории клеточных технологий Оренбургского государственного университета коллективом авторов разработан биопластический материал Гиаматрикс, который представляет собой наноструктурированный биополимер гиалуроновой кислоты в виде эластично-упругой пленки [10].

Биопластический материал получен из исходного гидрогеля гиалуроновой кислоты, подвергнутого воздействию ультрафиолетового облучения (λmax =230 нм), в результате чего происходит фотохимическая сшивка макромолекул (рис. 1). Благодаря данной технологии исключается наличие химических примесей в биоматериале, что, в свою очередь, снижает возможность аллергических реакций на материал.

Учитывая эффективность применения биоматериала при заболеваниях и ожогах кожи [11], а также общность эмбрионального происхождения дермы и переднего эпителия роговицы [12], нами было проведено исследование по применению Гиаматрикса для лечения механической эрозии и химических (щелочного и кислотного) ожогов роговицы.

Цель исследования — обосновать использование биопластического материала Гиаматрикс для лечения травматических повреждений роговицы.

Экспериментальное исследование проведено на 96 глазах 48 кроликов в трех сериях: в первой серии была смоделирована эрозия роговицы (12 кроликов, 24 глаза), во второй — щелочной ожог (18 кроликов, 36 глаз) и в третьей — кислотный ожог (18 кроликов, 36 глаз). Состояние животных оценивали динамически ежедневно в течение 7 сут, последующие наблюдения проводили 2 раза в неделю в сроки до 30 сут при формировании эрозии и до 90 сут при химическом ожоге роговицы.

Клинически оценивали характер инъекции конъюнктивы и ее выраженность, отек конъюнктивы, диаметр дефекта роговицы, интенсивность помутнения роговицы. На сроках 3, 7, 14, 30 и 90 сут животных выводили из эксперимента для проведения светооптического и иммуноцитохимического исследования.

Под местной анестезией с применением 0,4% раствора инокаина легким прижатием трепана с поршнем диаметром 8 мм на роговицу наносили метку, которую окрашивали 0,1% раствором флюоресцеина натрия. В пределах метки лезвием соскабливали эпителий роговицы. Дефект эпителия снова окрашивали раствором флюоресцеина для того, чтобы отчетливее были видны его форма и размер. После формирования эрозии роговицы в опытной группе (12 глаз кроликов) проводили аппликацию биопластического материала Гиаматрикс, а в контрольной группе (12 глаз) надевали мягкую контактную линзу (МКЛ) и фиксировали ее перекидными швами.

Методика формирования химического ожога в эксперименте заключалась в следующем: ожог вызывали аппликацией фильтровальной бумаги (в виде круга диаметром 8 мм), смоченной 2,5% раствором гидроксида натрия (в случае щелочного ожога) и 3% раствором уксусной кислоты (в случае кислотного ожога) с экспозицией 5 с на роговицу под местной анестезией 0,4% раствором инокаина. После промывания конъюнктивальной полости физиологическим раствором на роговицу помещали полоску индикаторной лакмусовой бумаги на 2—3 с, затем ее сравнивали с прилагаемой цветовой шкалой и вычисляли значение pH. Убедившись в достижении физиологического значения pH роговицы, промывание прекращали, в конъюнктивальную полость инстиллировали 0,4% раствор инокаина и 0,3% раствор ципромеда. Через сутки после формирования щелочного и кислотного ожогов в опытной группе (36 глаз) проводили аппликацию биопластического материала Гиаматрикс, а в контрольной группе (36 глаз) — инстилляции глазного геля Солкосерил 4 раза в день до полной эпителизации дефекта роговицы. Во всех группах выполняли инстилляции 0,3% раствора ципромеда 4 раза в день пока сохранялся дефект роговицы.

Аппликацию проводили по разработанной нами методике (патент на изобретение № 2485919 от 12.04.2012).

Предварительно из биоматериала Гиаматрикс трепаном выкраивали диск диаметром 10 мм. Затем его укладывали на поверхность роговицы и смачивали физиологическим раствором. Биоматериал накрывали МКЛ, которую фиксировали двумя перекидными швами по взаимно перпендикулярным меридианам, при этом вколы и выколы выполняли на расстоянии 0,5 мм от краев линзы, а лигатуру — поверх линзы.

Клиническое состояние глаз кроликов сразу после нанесения механической травмы до начала лечения в обеих группах характеризовалось признаками роговичного синдрома: светобоязнью, слезотечением, блефароспазмом. У экспериментальных животных объективно отмечали: конъюнктивальную инъекцию, поверхностный дефект роговицы, форму и величину которого определяли с помощью флюоресцеиновой пробы. Механическая эрозия как в опытной, так и в контрольной группе имела форму круга диаметром 8 мм (рис. 2, а). Биомикроскопия глаз животных опытной группы в 1-е сутки показала, что положение МКЛ было правильным, швы адаптированы, отмечался частичный лизис биоматериала по периферии. На 2-е сутки выраженность роговичного синдрома была меньше, роговица на большем протяжении становилась доступна осмотру в связи с процессом биодеградации биопластического материала, при этом отмечали положительную динамику в процессе эпителизации эрозии. На 3-и сутки после снятия МКЛ на роговице животных опытной группы при биомикроскопии дефекта не отмечали, что подтвердили результатом флюоресцеиновой пробы — отсутствием прокрашивания роговицы (см. рис. 2, б). При этом отмечали восстановление прозрачности, сферичности, гладкости, блеска и высокой чувствительности роговицы на всех глазах. В то время как в контрольной группе сохранялся роговичный синдром, флюоресцеиновая проба после снятия линзы на 3-и сутки показала прокрашивание дефекта в виде круга диаметром 4 мм (рис. 2, в). Полное закрытие механической эрозии отмечали только на 4-е сутки.

При морфологическом и морфометрическом изучении препаратов глаз опытной группы в сроки 3 сут было обнаружено, что в зоне механического дефекта роговицы активно происходила эпителизация дефекта эпителия. При этом клетки эпителия были дифференцированные, располагались в 3—4 ряда по периферии, ближе к центральной зоне эпителиоциты располагались в 2—3 ряда. В строме роговицы отмечалась слабая воспалительная реакция, которая проявлялась миграцией в слои роговицы лимфоцитов, более выраженная на периферии, с малым числом фибробластов. В контрольной группе отмечена высокая активность фибропластических процессов, вызванных эрозией, включавших дистрофические и остатки деструктивных изменений. При этом в центральной зоне дефекта клетки переднего эпителия были частично некротизированы, оставшаяся жизнеспособная часть эпителиоцитов была дискомплексирована (в ней отсутствовали фигуры митотического деления), а на периферии клетки эпителия были дифференцированные, располагались в 4 ряда, ближе к центральной зоне — в 2 ряда. В строме роговицы отмечали воспалительную реакцию, которая проявлялась миграцией в слои роговицы макрофагов и лимфоцитов, более выраженную на периферии, клеточная реакция с участием фибробластов продолжалась вплоть до 7-х суток.

По истечении 7 сут и далее роговица имела обычное строение, инфильтрация в слоях роговицы не определялась как в опытной, так и в контрольной группах.

Таким образом, аппликация Гиаматрикса не приводила к нарушению соединительнотканной структуры роговой оболочки и изменению стадийности физиологического ответа на травму роговицы. Асептическое воспаление при механическом воздействии на эпителий роговой оболочки, по данным морфологического исследования, завершалось в сроки 3 сут в опытной группе и 7 сут в контрольной группе. Клиническое исследование явных различий течения реактивного воспаления не выявило, но показало, что закрытие эрозии в опытной группе проходило быстрее, чем в контрольной. Учитывая положительные результаты аппликации Гиаматрикса при механической травме, мы применили биопластический материал при более агрессивном воздействии на роговицу.

Воздействие щелочи (2,5% раствора гидроксида натрия) на роговицу сопровождалось инъекцией конъюнктивы, помутнением роговицы, формированием дефекта эпителия роговицы, который прокрашивался флюоресцеином в виде круга диаметром 7 мм.

Динамическое наблюдение с проведением биомикроскопии в течение 2 нед после лечения показало, что эпителизация протекала следующим образом: в опытной группе на 7-е сутки отмечали закрытие дефекта (рис. 3, а), а в контрольной — уменьшение диаметра раневого дефекта до 3 мм с завершением эпителизации к 10—11-м суткам и в единичных случаях к 14—15-м суткам (см. рис. 3, б).

В опытной группе при оценке стромального помутнения у всех экспериментальных животных оно занимало оптическую зону роговицы и сохранялось до 7-х суток, а к 14-м суткам уменьшилось до размеров круга диаметром 4 мм, на месте которого формировалось нежное поверхностное помутнение. В контрольной группе стромальное помутнение сохранялось до 30-х суток, на его месте отмечали формирование стойкого помутнения.

На препаратах фрагмента роговицы кролика в условиях щелочного ожога после применения наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты на сроке 3 сут наблюдали явления, аналогичные контролю: десквамацию клеток переднего эпителия, лимитирование эпителизации раневой поверхности роговицы, отек и дискомплексацию волокон собственного вещества роговицы (рис. 4, а).

Различия были выявлены в контрольной и опытной группах лишь на сроке 7 сут, когда в опытных глазах обнаруживали эпителиальные пролифераты погружного и покровного характера (см. рис. 4, б), отмечали наличие новообразованного эпителиального пласта в центральной зоне повреждения тканей роговицы, а в контрольной группе — лишь формирование малодифференцированной соединительной ткани (см. рис. 4, в).

Существенным являлось то обстоятельство, что по мере продолжения развития деструктивного процесса (сроки 7 и 14 сут) в прилежащих к некротизированным тканям участках возникало выраженное вторичное реактивное воспаление. Оно характеризовалось вазодилатацией кровеносных сосудов, экстравазацией плазмы и форменных элементов крови с формированием демаркационной зоны. Анализируя серийные гистологические препараты, мы отметили, что демаркационная линия в исследованных участках глаза была выражена слабо, а в лимбальной зоне она отсутствовала. Это приводило к утяжелению и прогрессированию некротических процессов эпителиальных и соединительнотканных структур.

В сроки свыше 2 нед процессы как в опытной, так и в контрольной группах были сходными, ведущими к стабилизации раневого процесса. Однако их завершение в опытной группе было быстрее. Для подтверждения этого было проведено иммуноцитохимическое исследование, которое показало, что при применении Гиаматрикса снижалась апоптотическая доминанта эпителиоцитов и фибробластов роговицы, взятой для исследования на 3-и и 14-е сутки эксперимента. С другой стороны, возрастала экспрессия синтеза протеина bcl2, что свидетельствовало о выраженности пролиферативной фазы воспаления (см. таблицу). Таким образом, иммуноцитохимическое исследование показало, что аппликация Гиаматрикса оптимизировала репаративные гистогенезы с включением механизмов лимитирования экспрессии проапоптотического гена p53, уменьшением количества иммунопозитивных эпителиоцитов в 2,5—3 раза по сравнению с таковым в контрольной группе.

На протяжении стадии ранних исходов ожогового процесса, до 30-х суток с момента ожога, субэпителиально осуществлялись фибропластические процессы, формировалась грануляционная ткань. В стадии отдаленных исходов ожогового процесса, свыше 30 сут с момента ожога, происходило ремоделирование рубца с его истончением, уменьшением количества клеточных элементов, дифференцировкой фибробластов в фиброциты, запустеванием новообразованных сосудов.

В зоне щелочного ожога поврежденная ткань в ряде случаев замещалась рубцовой тканью, отмечался рост неполноценных новообразованных сосудов, которые располагались как поверхностно, так и глубоко.

Клиническое исследование показало, что сразу после действия 3% раствора уксусной кислоты на роговицу возникало ее поверхностное помутнение. При инстилляции 0,1% раствора флюоресцеина натрия прокрашивания роговицы не отмечали. Но наряду с этим наблюдали признаки роговичного синдрома, инъекцию и отек конъюнктивы.

Клиническое наблюдение показало, что отек роговицы на всех глазах опытной группы сохранялся до 7 сут, в то время как в контрольной группе — до 14 сут.

Инъекция конъюнктивы в опытной группе усиливалась в первые 3 сут после аппликации, что могло быть связано с фиксацией МКЛ, а затем наблюдали положительную динамику и полное исчезновение инъекции к 8—9-м суткам. В контрольной группе инъекция конъюнктивы уменьшалась медленнее и проходила полностью к 14-м суткам.

Морфологические изменения роговицы при кислотном ожоге имели особенности, обусловливающие соответствующую клиническую картину. При исходном состоянии повреждения эпителия они представляли собой коагуляционный некроз поверхностных слоев с формированием плотного струпа на роговице, что проявлялось роговичным синдромом, но не давало возможности прокрашивания стромы флюоресцеином и приводило к ложноотрицательному результату пробы. Световая микроскопия на сроке 3 сут в обеих группах показала наличие деструктивных изменений эпителиоцитов, формирование тромбов в мелких сосудах, что объясняло стаз крови и экстравазацию плазмы, клинически проявляющихся отеком конъюнктивы. Кроме деструктивных изменений эпителиоцитов, отмечались нарушения в строме, которые строго соответствовали участку ожога и захватывали не менее 1/3 толщины стромы. Таким образом, при кислотном ожоге в отличие от щелочного ожога возникал коагуляционный (сухой) некроз — кислотная денатурация белков, благодаря которой кислота не проникала в подлежащие слои ткани.

Иммуноцитохимические исследования при кислотном ожоге, так же как и при щелочном, свидетельствовали о снижении апоптотической доминанты эпителиоцитов и фибробластов, но с возрастанием экспрессии синтеза протеина bcl2 и, следовательно, выраженности пролиферативной фазы воспаления.

На сроке наблюдения от 30 сут и выше наблюдали завершение фибробластических процессов как в опытной, так и в контрольной группе.

Результаты проведенного экспериментально-морфологического исследования свидетельствуют о том, что применение наноструктурированного биопластического материала гиалуроновой кислоты при механических повреждениях роговицы ускоряет эпителизацию эрозии на 3—4 дня по сравнению с контрольной группой.

Применение нового метода аппликации биопластического материала из гиалуроновой кислоты сокращает течение экссудативной фазы воспаления, ускоряет закрытие дефекта и способствует формированию более нежного помутнения и восстановлению роговицы после химического ожога.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.К., А.С.

Сбор и обработка материала: О.Я.

Статистическая обработка: А.С.

Написание текста: О.Я.

Редактирование: О.Т.

Конфликт интересов отсутствует.