Канюков В.Н.

ОФ ФГБУ «МНТК “Микрохирургия глаза” им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, Салмышская ул., 17, Оренбург, Российская Федерация, 460047

Стадников А.А.

ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздрава России, Советская ул., 6, Оренбург, Российская Федерация, 460000

Трубина О.М.

ОФ ФГБУ «МНТК “Микрохирургия глаза” им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, Салмышская ул., 17, Оренбург, Российская Федерация, 460047

Яхина О.М.

ОФ ФГБУ «МНТК “Микрохирургия глаза” им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, Салмышская ул., 17, Оренбург, Российская Федерация, 460047

Применение наноструктурированного биопластического материала при травматических повреждениях роговицы

Журнал: Вестник офтальмологии. 2015;131(1): 43-49

Просмотров : 41

Загрузок :

Как цитировать

Канюков В. Н., Стадников А. А., Трубина О. М., Яхина О. М. Применение наноструктурированного биопластического материала при травматических повреждениях роговицы. Вестник офтальмологии. 2015;131(1):43-49. https://doi.org/10.17116/oftalma2015131143-48

Авторы:

Канюков В.Н.

ОФ ФГБУ «МНТК “Микрохирургия глаза” им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России, Салмышская ул., 17, Оренбург, Российская Федерация, 460047

Все авторы (4)

По данным исследований, в Российской Федерации насчитывается более 500 тыс. слепых и слабовидящих, из них до 18% приходится на пациентов с патологией роговицы [1].

Этиопатогенетические факторы, приводящие к нарушению целостности и прозрачности роговой оболочки, весьма разнообразны: травмы и ожоги, воспалительные заболевания и дистрофии. Данные заболевания нередко приводят к формированию бельма, т. е. к замещению структуры роговицы грубой волокнистой соединительной тканью с новообразованными сосудами [2—5]. В качестве временного покрытия, являющегося протектором восстановления ткани роговицы, используют консервированную донорскую роговицу, но в связи с трудностями с забором кадаверной роговицы прибегают к использованию различных видов биологических покрытий: конъюнктивы, трансплантатов из твердой мозговой оболочки, склеры, амниотической мембраны, аллопланта [6—8]. Однако применение каждого из указанных материалов не лишено недостатков. Это связано с нанесением дополнительной хирургической травмы при заборе материала, ограниченным количеством доступной ткани, а в случаях аллопластики — с возможной тканевой несовместимостью, вследствие чего все большее предпочтение отдается синтетическим материалам [9].

В научно-производственной лаборатории клеточных технологий Оренбургского государственного университета коллективом авторов разработан биопластический материал Гиаматрикс, который представляет собой наноструктурированный биополимер гиалуроновой кислоты в виде эластично-упругой пленки [10].

Биопластический материал получен из исходного гидрогеля гиалуроновой кислоты, подвергнутого воздействию ультрафиолетового облучения (λmax =230 нм), в результате чего происходит фотохимическая сшивка макромолекул (рис. 1). Благодаря данной технологии исключается наличие химических примесей в биоматериале, что, в свою очередь, снижает возможность аллергических реакций на материал.

Рис. 1. Наноструктурированный биопластический материал Гиаматрикс (изображение при атомно-силовой микроскопии).

Учитывая эффективность применения биоматериала при заболеваниях и ожогах кожи [11], а также общность эмбрионального происхождения дермы и переднего эпителия роговицы [12], нами было проведено исследование по применению Гиаматрикса для лечения механической эрозии и химических (щелочного и кислотного) ожогов роговицы.

Цель исследования — обосновать использование биопластического материала Гиаматрикс для лечения травматических повреждений роговицы.

Материал и методы

Экспериментальное исследование проведено на 96 глазах 48 кроликов в трех сериях: в первой серии была смоделирована эрозия роговицы (12 кроликов, 24 глаза), во второй — щелочной ожог (18 кроликов, 36 глаз) и в третьей — кислотный ожог (18 кроликов, 36 глаз). Состояние животных оценивали динамически ежедневно в течение 7 сут, последующие наблюдения проводили 2 раза в неделю в сроки до 30 сут при формировании эрозии и до 90 сут при химическом ожоге роговицы.

Клинически оценивали характер инъекции конъюнктивы и ее выраженность, отек конъюнктивы, диаметр дефекта роговицы, интенсивность помутнения роговицы. На сроках 3, 7, 14, 30 и 90 сут животных выводили из эксперимента для проведения светооптического и иммуноцитохимического исследования.

Под местной анестезией с применением 0,4% раствора инокаина легким прижатием трепана с поршнем диаметром 8 мм на роговицу наносили метку, которую окрашивали 0,1% раствором флюоресцеина натрия. В пределах метки лезвием соскабливали эпителий роговицы. Дефект эпителия снова окрашивали раствором флюоресцеина для того, чтобы отчетливее были видны его форма и размер. После формирования эрозии роговицы в опытной группе (12 глаз кроликов) проводили аппликацию биопластического материала Гиаматрикс, а в контрольной группе (12 глаз) надевали мягкую контактную линзу (МКЛ) и фиксировали ее перекидными швами.

Методика формирования химического ожога в эксперименте заключалась в следующем: ожог вызывали аппликацией фильтровальной бумаги (в виде круга диаметром 8 мм), смоченной 2,5% раствором гидроксида натрия (в случае щелочного ожога) и 3% раствором уксусной кислоты (в случае кислотного ожога) с экспозицией 5 с на роговицу под местной анестезией 0,4% раствором инокаина. После промывания конъюнктивальной полости физиологическим раствором на роговицу помещали полоску индикаторной лакмусовой бумаги на 2—3 с, затем ее сравнивали с прилагаемой цветовой шкалой и вычисляли значение pH. Убедившись в достижении физиологического значения pH роговицы, промывание прекращали, в конъюнктивальную полость инстиллировали 0,4% раствор инокаина и 0,3% раствор ципромеда. Через сутки после формирования щелочного и кислотного ожогов в опытной группе (36 глаз) проводили аппликацию биопластического материала Гиаматрикс, а в контрольной группе (36 глаз) — инстилляции глазного геля Солкосерил 4 раза в день до полной эпителизации дефекта роговицы. Во всех группах выполняли инстилляции 0,3% раствора ципромеда 4 раза в день пока сохранялся дефект роговицы.

Аппликацию проводили по разработанной нами методике (патент на изобретение № 2485919 от 12.04.2012).

Предварительно из биоматериала Гиаматрикс трепаном выкраивали диск диаметром 10 мм. Затем его укладывали на поверхность роговицы и смачивали физиологическим раствором. Биоматериал накрывали МКЛ, которую фиксировали двумя перекидными швами по взаимно перпендикулярным меридианам, при этом вколы и выколы выполняли на расстоянии 0,5 мм от краев линзы, а лигатуру — поверх линзы.

Результаты и обсуждение

Клиническое состояние глаз кроликов сразу после нанесения механической травмы до начала лечения в обеих группах характеризовалось признаками роговичного синдрома: светобоязнью, слезотечением, блефароспазмом. У экспериментальных животных объективно отмечали: конъюнктивальную инъекцию, поверхностный дефект роговицы, форму и величину которого определяли с помощью флюоресцеиновой пробы. Механическая эрозия как в опытной, так и в контрольной группе имела форму круга диаметром 8 мм (рис. 2, а). Биомикроскопия глаз животных опытной группы в 1-е сутки показала, что положение МКЛ было правильным, швы адаптированы, отмечался частичный лизис биоматериала по периферии. На 2-е сутки выраженность роговичного синдрома была меньше, роговица на большем протяжении становилась доступна осмотру в связи с процессом биодеградации биопластического материала, при этом отмечали положительную динамику в процессе эпителизации эрозии. На 3-и сутки после снятия МКЛ на роговице животных опытной группы при биомикроскопии дефекта не отмечали, что подтвердили результатом флюоресцеиновой пробы — отсутствием прокрашивания роговицы (см. рис. 2, б). При этом отмечали восстановление прозрачности, сферичности, гладкости, блеска и высокой чувствительности роговицы на всех глазах. В то время как в контрольной группе сохранялся роговичный синдром, флюоресцеиновая проба после снятия линзы на 3-и сутки показала прокрашивание дефекта в виде круга диаметром 4 мм (рис. 2, в). Полное закрытие механической эрозии отмечали только на 4-е сутки.

Рис. 2. Состояние роговицы и конъюнктивы после механической эрозии. а — исходное состояние, величина и форма эрозии определяются при помощи флюоресцеиновой пробы; б — закрытие эрозии на 3-и сутки (опытная группа); в — сохранение дефекта роговицы на 3-и сутки (контрольная группа).

При морфологическом и морфометрическом изучении препаратов глаз опытной группы в сроки 3 сут было обнаружено, что в зоне механического дефекта роговицы активно происходила эпителизация дефекта эпителия. При этом клетки эпителия были дифференцированные, располагались в 3—4 ряда по периферии, ближе к центральной зоне эпителиоциты располагались в 2—3 ряда. В строме роговицы отмечалась слабая воспалительная реакция, которая проявлялась миграцией в слои роговицы лимфоцитов, более выраженная на периферии, с малым числом фибробластов. В контрольной группе отмечена высокая активность фибропластических процессов, вызванных эрозией, включавших дистрофические и остатки деструктивных изменений. При этом в центральной зоне дефекта клетки переднего эпителия были частично некротизированы, оставшаяся жизнеспособная часть эпителиоцитов была дискомплексирована (в ней отсутствовали фигуры митотического деления), а на периферии клетки эпителия были дифференцированные, располагались в 4 ряда, ближе к центральной зоне — в 2 ряда. В строме роговицы отмечали воспалительную реакцию, которая проявлялась миграцией в слои роговицы макрофагов и лимфоцитов, более выраженную на периферии, клеточная реакция с участием фибробластов продолжалась вплоть до 7-х суток.

По истечении 7 сут и далее роговица имела обычное строение, инфильтрация в слоях роговицы не определялась как в опытной, так и в контрольной группах.

Таким образом, аппликация Гиаматрикса не приводила к нарушению соединительнотканной структуры роговой оболочки и изменению стадийности физиологического ответа на травму роговицы. Асептическое воспаление при механическом воздействии на эпителий роговой оболочки, по данным морфологического исследования, завершалось в сроки 3 сут в опытной группе и 7 сут в контрольной группе. Клиническое исследование явных различий течения реактивного воспаления не выявило, но показало, что закрытие эрозии в опытной группе проходило быстрее, чем в контрольной. Учитывая положительные результаты аппликации Гиаматрикса при механической травме, мы применили биопластический материал при более агрессивном воздействии на роговицу.

Воздействие щелочи (2,5% раствора гидроксида натрия) на роговицу сопровождалось инъекцией конъюнктивы, помутнением роговицы, формированием дефекта эпителия роговицы, который прокрашивался флюоресцеином в виде круга диаметром 7 мм.

Динамическое наблюдение с проведением биомикроскопии в течение 2 нед после лечения показало, что эпителизация протекала следующим образом: в опытной группе на 7-е сутки отмечали закрытие дефекта (рис. 3, а), а в контрольной — уменьшение диаметра раневого дефекта до 3 мм с завершением эпителизации к 10—11-м суткам и в единичных случаях к 14—15-м суткам (см. рис. 3, б).

Рис. 3. Состояние роговицы и конъюнктивы после щелочного ожога. а — закрытие дефекта на 7-е сутки (опытная группа); б — закрытие дефекта на 14-е сутки (контрольная группа).

В опытной группе при оценке стромального помутнения у всех экспериментальных животных оно занимало оптическую зону роговицы и сохранялось до 7-х суток, а к 14-м суткам уменьшилось до размеров круга диаметром 4 мм, на месте которого формировалось нежное поверхностное помутнение. В контрольной группе стромальное помутнение сохранялось до 30-х суток, на его месте отмечали формирование стойкого помутнения.

На препаратах фрагмента роговицы кролика в условиях щелочного ожога после применения наноструктурированного биополимера гиалуроновой кислоты на сроке 3 сут наблюдали явления, аналогичные контролю: десквамацию клеток переднего эпителия, лимитирование эпителизации раневой поверхности роговицы, отек и дискомплексацию волокон собственного вещества роговицы (рис. 4, а).

Рис. 4. Фрагмент роговицы кролика после щелочного ожога. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400. а — на 1-е сутки. Отек и дискомплексация волокон собственного вещества роговицы, десквамация клеток переднего эпителия; б — на 7-е сутки. Эпителиальные пролифераты погружного и покровного характера (опытная группа); в — на 7-е сутки. Формирование малодифференцированной соединительной ткани (контрольная группа).

Различия были выявлены в контрольной и опытной группах лишь на сроке 7 сут, когда в опытных глазах обнаруживали эпителиальные пролифераты погружного и покровного характера (см. рис. 4, б), отмечали наличие новообразованного эпителиального пласта в центральной зоне повреждения тканей роговицы, а в контрольной группе — лишь формирование малодифференцированной соединительной ткани (см. рис. 4, в).

Существенным являлось то обстоятельство, что по мере продолжения развития деструктивного процесса (сроки 7 и 14 сут) в прилежащих к некротизированным тканям участках возникало выраженное вторичное реактивное воспаление. Оно характеризовалось вазодилатацией кровеносных сосудов, экстравазацией плазмы и форменных элементов крови с формированием демаркационной зоны. Анализируя серийные гистологические препараты, мы отметили, что демаркационная линия в исследованных участках глаза была выражена слабо, а в лимбальной зоне она отсутствовала. Это приводило к утяжелению и прогрессированию некротических процессов эпителиальных и соединительнотканных структур.

В сроки свыше 2 нед процессы как в опытной, так и в контрольной группах были сходными, ведущими к стабилизации раневого процесса. Однако их завершение в опытной группе было быстрее. Для подтверждения этого было проведено иммуноцитохимическое исследование, которое показало, что при применении Гиаматрикса снижалась апоптотическая доминанта эпителиоцитов и фибробластов роговицы, взятой для исследования на 3-и и 14-е сутки эксперимента. С другой стороны, возрастала экспрессия синтеза протеина bcl2, что свидетельствовало о выраженности пролиферативной фазы воспаления (см. таблицу). Таким образом, иммуноцитохимическое исследование показало, что аппликация Гиаматрикса оптимизировала репаративные гистогенезы с включением механизмов лимитирования экспрессии проапоптотического гена p53, уменьшением количества иммунопозитивных эпителиоцитов в 2,5—3 раза по сравнению с таковым в контрольной группе.

Динамика р53-позитивных и bcl2-позитивных клеток регенерата роговицы

На протяжении стадии ранних исходов ожогового процесса, до 30-х суток с момента ожога, субэпителиально осуществлялись фибропластические процессы, формировалась грануляционная ткань. В стадии отдаленных исходов ожогового процесса, свыше 30 сут с момента ожога, происходило ремоделирование рубца с его истончением, уменьшением количества клеточных элементов, дифференцировкой фибробластов в фиброциты, запустеванием новообразованных сосудов.

В зоне щелочного ожога поврежденная ткань в ряде случаев замещалась рубцовой тканью, отмечался рост неполноценных новообразованных сосудов, которые располагались как поверхностно, так и глубоко.

Клиническое исследование показало, что сразу после действия 3% раствора уксусной кислоты на роговицу возникало ее поверхностное помутнение. При инстилляции 0,1% раствора флюоресцеина натрия прокрашивания роговицы не отмечали. Но наряду с этим наблюдали признаки роговичного синдрома, инъекцию и отек конъюнктивы.

Клиническое наблюдение показало, что отек роговицы на всех глазах опытной группы сохранялся до 7 сут, в то время как в контрольной группе — до 14 сут.

Инъекция конъюнктивы в опытной группе усиливалась в первые 3 сут после аппликации, что могло быть связано с фиксацией МКЛ, а затем наблюдали положительную динамику и полное исчезновение инъекции к 8—9-м суткам. В контрольной группе инъекция конъюнктивы уменьшалась медленнее и проходила полностью к 14-м суткам.

Морфологические изменения роговицы при кислотном ожоге имели особенности, обусловливающие соответствующую клиническую картину. При исходном состоянии повреждения эпителия они представляли собой коагуляционный некроз поверхностных слоев с формированием плотного струпа на роговице, что проявлялось роговичным синдромом, но не давало возможности прокрашивания стромы флюоресцеином и приводило к ложноотрицательному результату пробы. Световая микроскопия на сроке 3 сут в обеих группах показала наличие деструктивных изменений эпителиоцитов, формирование тромбов в мелких сосудах, что объясняло стаз крови и экстравазацию плазмы, клинически проявляющихся отеком конъюнктивы. Кроме деструктивных изменений эпителиоцитов, отмечались нарушения в строме, которые строго соответствовали участку ожога и захватывали не менее 1/3 толщины стромы. Таким образом, при кислотном ожоге в отличие от щелочного ожога возникал коагуляционный (сухой) некроз — кислотная денатурация белков, благодаря которой кислота не проникала в подлежащие слои ткани.

Иммуноцитохимические исследования при кислотном ожоге, так же как и при щелочном, свидетельствовали о снижении апоптотической доминанты эпителиоцитов и фибробластов, но с возрастанием экспрессии синтеза протеина bcl2 и, следовательно, выраженности пролиферативной фазы воспаления.

На сроке наблюдения от 30 сут и выше наблюдали завершение фибробластических процессов как в опытной, так и в контрольной группе.

Заключение

Результаты проведенного экспериментально-морфологического исследования свидетельствуют о том, что применение наноструктурированного биопластического материала гиалуроновой кислоты при механических повреждениях роговицы ускоряет эпителизацию эрозии на 3—4 дня по сравнению с контрольной группой.

Применение нового метода аппликации биопластического материала из гиалуроновой кислоты сокращает течение экссудативной фазы воспаления, ускоряет закрытие дефекта и способствует формированию более нежного помутнения и восстановлению роговицы после химического ожога.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.К., А.С.

Сбор и обработка материала: О.Я.

Статистическая обработка: А.С.

Написание текста: О.Я.

Редактирование: О.Т.

Конфликт интересов отсутствует.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail