Роль дисфункции нейтрофилов в патогенезе системной красной волчанки

ВН — волчаночный нефрит

ГАМП — гранулярные антимикробные

пептиды

ГНП — гранулоциты низкой плотности

ДК — дендритные клетки

ИК — иммунные комплексы

ИЛ — интерлейкин

ММП — матриксные металлопротеиназы

НАДФН — восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотидфосфата

НВЛ — нейтрофильные внеклеточные ловушки

СКВ — системная красная волчанка

BAFF — фактор, активирующий В-клетки

PAD-4 — пептидиларгининдеиминаза-4

TLR9 — toll-подобный рецептор-9

α-ФНО — α-фактор некроза опухоли

Системная красная волчанка (СКВ) — системное аутоиммунное заболевание неустановленной этиологии, характеризующееся нарушением толерантности к широкому спектру компонентов клеточного ядра с развитием иммуновоспалительного повреждения тканей.

Нарушение функции нейтрофилов при СКВ играет значительную роль. Они являются важнейшими регуляторами врожденного и приобретенного иммунитета, а также участвуют в развитии реакций аутовоспаления и аутоиммунитета.

Нейтрофилы представляют наиболее многочисленную группу лейкоцитов, играющих главную роль на первых этапах развития воспаления в ответ на повреждение или воздействие микроорганизмов. Защитная функция нейтрофилов осуществляется посредством различных механизмов: выделение гранулярных антимикробных пептидов (ГАМП), например, миелопероксидазы, эластазы нейтрофилов и матриксных металлопротеиназ (ММП); фагоцитоз микроорганизмов с последующей деградацией с помощью активных форм кислорода внутри фаголизосом; осуществление бактерицидного действия в ходе нетоза — одного из механизмов смерти клетки, характерного для нейтрофилов. Нетоз впервые описан в 2004 г. Он представляет процесс, при котором в нейтрофилах под воздействием эндогенных индуцирующих агентов, например интерлейкинов (ИЛ) 6, 8, α-фактора некроза опухоли (α-ФНО), или внешних стимулов, например форболмиристатацетата, происходит активация рецепторов на внешней мембране, запускающая каскад внутриклеточных реакций. Это вызывает выход кальция из гладкой эндоплазматической сети, активации ядерной пептидиларгининдеиминазы-4 (PAD-4), цитруллинированию гистонов и декондесации хроматина. В результате происходит выбрасывание во внеклеточное пространство «сетеподобных» структур, состоящих из хроматина и ГАМП и называемых также нейтрофильными внеклеточными ловушками (НВЛ). В них происходят захват и инактивация патогенных микроорганизмов.

Наблюдаемая при СКВ нейтропения имеет множество причин, включающих образование антител непосредственно к лейкоцитам, нейтрализующих аутоантитела к факторам роста нейтрофилов и клеткам — предшественникам миелоидного ряда, супрессию костного мозга, участие нейтрофилов в процессах апоптоза и нетоза.

Для СКВ описан ряд структурных и функциональных нарушений нейтрофилов.

Для фракции мононуклеарных клеток периферической крови больных СКВ характерна повышенная экспрессия мРНК генов, специфичных для субпопуляции гранулоцитов низкой плотности (ГНП) [1]. ГНП экспрессируют поверхностные антигены, аналогичные зрелым нейтрофилам, но отличаются от них морфологией ядер, соответствующих незрелому фенотипу. Представляется, что ГНП обладают провоспалительной способностью, а также повышенной способностью синтезировать провоспалительные цитокины, включая интерфероны (ИФН) 1, 2 и α-ФНО, а также непосредственно разрушать эндотелиальные клетки [2].

Генетические исследования с применением биологических микрочипов показали наличие более высокого уровня мРНК генов, кодирующих различные иммуностимулирующие бактерицидные белки и алармины азурофильных гранул, в ГНП по сравнению с нейтрофилами нормальной плотности у больных СКВ и контрольной группы здоровых людей. С учетом того, что уровень мРНК сериновых протеаз нейтрофилов наиболее высок в промиелоцитарную стадию их созревания в костном мозге и снижается по мере созревания клеток, предположено, что ГНП обладают менее зрелым фенотипом по сравнению с нейтрофилами нормальной плотности. Это подтверждают исследования экспрессии генов в костном мозге при СКВ, которые позволили обнаружить сходство генных сетей при активной СКВ и неходжкинской лимфоме. В связи с этим, возможно, ГНП представляют собой патологическую незрелую популяцию нейтрофилов, берущую начало в костном мозге, способную распространяться с кровотоком в другие ткани у больных СКВ [2].

С помощью цитогенетического матричного анализа обнаружено, что ГНП обладают более высоким уровнем вариаций числа копий генов, а также потери гетерозиготности и микросателлитной нестабильности. В нейтрофилах нормальной плотности не обнаружены подобные изменения, что подтверждает особенность ГНП как отдельной субпопуляции гранулоцитов [3].

Ряд авторов показали, что в патогенезе СКВ значительную роль играет нарушение процесса образования НВЛ, а также удаления продуктов нетоза [4, 5]. Обнаружено, что ГНП при СКВ способны формировать НВЛ ex vivo в отсутствие дополнительной стимуляции. Уровень нетоза в периферическом кровотоке и в тканях коррелирует с титром циркулирующих антител к ДНК. В тканях кожи и почек больных СКВ обнаружена инфильтрация нейтрофилами, находящимися в процессе нетоза. Сыворотка больных СКВ содержит иммунные комплексы (ИК), состоящие из аутоантител к антибактериальным пептидам нейтрофилов, например кателицидину, а также антитела к ДНК, связанные с НВЛ. Эти И.К. препятствуют деградации собственной ДНК нуклеазами, тем самым способствуя их захвату плазмоцитоидными дендритными клетками (ДК) [5], запуская активацию рецептора toll-подобного рецептора-9 (TLR9) в плазмоцитоидных ДК и синтез ИФН-α, цитокина, способного инициировать дальнейшую продукцию НВЛ [5]. У больных СКВ после активации нейтрофилов с помощью ИФН-α антитела к рибонуклеопротеину стимулируют образование НВЛ нейтрофилами [4]. Примерно у 1/3 больных СКВ обнаруживают нарушение деградации НВЛ ДНКазой I, наблюдаемое в норме у здоровых людей [6], что коррелирует с высоким уровнем антинуклеарных антител и антител к НВЛ, а также наличием волчаночного нефрита (ВН) и активацией системы комплемента. Компоненты НВЛ вызывают активацию системы комплемента, что приводит к отложению C1q на НВЛ и нарушению их деградации. НВЛ и пептид кателицидин, связанный с НВЛ, также стимулируют инфламмасомы криопиринового типа в макрофагах у больных СКВ, что может в дальнейшем способствовать развитию провоспалительного ответа в различных органах, включая почки и сосуды, за счет повышения продукции ИЛ-18 и ИЛ-1β, а также разрушению эндотелиальных клеток [2, 7].

Нарушения образования НВЛ также изучают на моделях животных с СКВ. На экспериментальной модели аутоиммунитета (индуцированного введением пристана крысам) обнаружена экспрессия кателицидина в селезенке и суставах, при этом уровень экспрессии кателицидина коррелировал с уровнем ГНП в крови. После инъекции пристана экспрессия кателицидина коррелировала с высоким уровнем апоптоза, продукцией ИФН-1 и аутоантител.

На модели мышы NZM2328 СКВ показано повышенное образование НВЛ нейтрофилами костного мозга. Кроме того, факторы, находящиеся в сыворотке мышей линии NZM2328, вызывали образование НВЛ нейтрофилами у контрольных животных, в их сыворотке обнаружены антитела к компонентам НВЛ и антитела к кателицидину. Аналогично результатам, полученным в биоптатах почек человека, для образцов ткани почек мышей линии NZM2328 характерна инфильтрация нейтрофилами, образующими НВЛ, а также показано, что НВЛ непосредственно способны нарушать функцию эндотелия. При введении данным мышам хлорамидина (необратимого ингибитора PAD-4) наблюдали снижение образования НВЛ, активации комплемента и значительно меньшее отложение ИК в почках. Вместе с тем отмечали повышение уровня аутоантител в сыворотке крови, возможно, ввиду уменьшения отложения ИК в тканях. Кроме того, при подавлении нетоза у мышей отмечено улучшение функции эндотелия, репарации сосудов, снижение риска развития тромботических осложнений. Данные результаты указывают на то, что зависимое от PAD-4 образование НВЛ играет роль в патогенезе СКВ, а также связано с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний.

Так как для СКВ характерно повышенное образование НВЛ, то в настоящее время особую актуальность представляет разработка методик для определения компонентов НВЛ с целью изучения влияния данного клеточного процесса на активность и прогноз заболевания. В исследовании показано, что уровень внеклеточной ДНК (вкДНК) значительно выше у больных СКВ, чем у здоровых лиц. Более того, обнаружено, что у больных с активным ВН уровень вкДНК значительно выше, чем у больных с неактивным В.Н. Наблюдали прямую корреляцию концентрации вкДНК с уровнем протеинурии, количеством как нейтрофилов в целом, так и ГНП [8].

Тип посттрансляционной модификации (ацетилирование, цитруллинирование и метилирование) гистонов (Н1, Н2А, Н2 В, Н3, Н4) может указывать на тип смерти клетки, которой подверглись нейтрофилы, и служить маркером повышенной активности нейтрофилов при СКВ [9, 10]. Обнаружено, что НВЛ при СКВ по сравнению с контрольной группой содержит значительно большее количество гистонов (Н4-К8, Н4-К12, Н4-К16, Н2В-К12) с гиперацетилированным и триметилированным (Н3-К27) лизином [9]. Кроме того, показано, что линкерный гистон Н1 подвергается цитруллинированию под действием PAD-4 при формировании НВЛ, модифицированный гистон является важным аутоантигеном в патогенезе СКВ [11].

Еще одним маркером повышенной активности нейтрофилов при СКВ может быть наличие в сыворотке белков нейтрофильных гранул. Так, показано, что нейтрофильные α-дефензины (HNP1−3) сыворотки являются независимыми маркерами ВН, их уровень прямо коррелирует с уровнем протеинурии и активностью заболевания.

Белок липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (NGAL), известный также как липокалин-2 (гранулярный белок, высвобождаемый во внеклеточную среду в ходе нетоза), рассматривают на данный момент как один из наиболее перспективных биомаркеров ВН [1]. Выявлено, что его уровень коррелирует с активностью и прогрессированием заболевания, а также с ответом на лечение. Несомненно, необходимы дальнейшие исследования на больших группах больных для более точной оценки чувствительности и специфичности данных биомаркеров.

В ходе ряда исследований показано, что нейтрофилы способны не только продуцировать провоспалительные цитокины, но и участвовать в регуляции адаптивного иммунитета, что имеет особое значение в патогенезе СКВ [12]. В исследовании у больных СКВ и мышиных моделях СКВ показано, что нейтрофилы костного мозга являются основными продуцентами ИФН-1, а также цитокинов, активирующих В-клетки: лиганда А, индуцирующего пролиферацию (APRIL), и фактора, активирующего В-клетки (BAFF). Существует также предположение, что нейтрофилы селезенки способны активировать В- и Т-клетки, так как снижение уровня нейтрофилов приводит к уменьшению количества В-клеток в герминативных центрах лимфатических узлов, уровня аутоантител, экспрессии BAFF, а также количества ИНФγ⁺ Т-клеток [13].

В одном из исследований метилома ДНК нейтрофилов при СКВ, ГНП и нейтрофилов контрольной группы выявлено стойкое метилирование группы генов, связанных с экспрессией ИФН-1. Данный факт позволяет предположить, что высвобождение гипометилированной ДНК нейтрофилами в ходе нетоза при СКВ усиливает продукцию ИФН-1 через стимуляцию TLR-9.

Нуждаются в дальнейшем изучении механизмы, приводящие к повышенному образованию НВЛ и нарушению их деградации при СКВ. Необходимо также исследование терапевтических возможностей подавления формирования НВЛ при СКВ. Согласно упомянутым исследованиям на грызунах потенциальным терапевтическим действием с подобной направленностью могут обладать ингибиторы PAD-4, необходимого для формирования НВЛ.

Показано, что патология формирования НВЛ вызывает также повреждение эндотелия и повышает вероятность тромбозов [9, 14]. В НВЛ, которые образуют ГНП при СКВ, происходит высвобождение MMП-9, активирующей эндотелиальную MMП-2, которая запускает процесс апоптоза эндотелиальных клеток. Подавление каскада реакций, связанных с MMП-9, позволяет восстановить функцию эндотелия и ограничить негативное влияние на сосудистое русло. Кроме того, установлено, что при СКВ иммунные комплексы, содержащие MMП-9 и анти-MMП, стимулируют образование НВЛ, а также дальнейшее развитие патологического процесса в сосудистом русле [2].

Изучение НВЛ также может помочь понять более точный механизм действия препаратов, успешно применяемых в клинической практике для лечения СКВ. Так, обнаружена способность хлорохина подавлять формирование НВЛ in vitro. Показано, что аналогичное действие оказывает циклоспорин, А — ингибитор кальциневрина, кальцийзависимой фосфатазы, участвующей в регуляции экспрессии оксидазы восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН-оксидазы), которая играет ключевую роль в индукции нетоза.

Создание новых лекарственных препаратов, действующих на определенные звенья процесса образования НВЛ или способствующих их удалению из внеклеточной среды, может вывести терапию СКВ и других аутоиммунных заболеваний на новый уровень. Потенциальными терапевтическими мишенями на данный момент являются ингибиторы НАДФН-оксидазы, продукции РФК митохондриями, актинового цитоскелета и ферментов PAD.

Авторы заявляют об отсутствии конфликтаинтересов.

Сведения об авторах

Краснова Татьяна Николаевна — к.м.н., доц. каф. внутренних болезней факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова

Проскурнина Елена Васильевна — к.х.н., доц. каф. медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова

Мухин Николай Алексеевич — д.м.н., проф., акад. РАН, дир.клиники нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева, зав. каф. внутренних болезней факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова

Смирнова Елена Владимировна — асп. каф. внутренних болезней факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова; e-mail: elena.smirnova881@gmail.com