Тромбоциты инициируют процесс артериального тромбообразования в участках повреждения сосудистой стенки. Наиболее часто такое повреждение происходит в результате разрушения атеросклеротических бляшек, которое сопровождается нарушением целостности атромбогенного слоя эндотелиальных клеток и приводят к контакту тромбоцитов с тромбогенными компонентами, локализованными в субэндотелиальных слоях сосудистой стенки. Последующие адгезия и агрегация тромбоцитов в месте повреждения представляют собой первичные стадии формирования пристеночных и окклюзирующих тромбов - патогенетической основы инфаркта миокарда и нестабильной стенокардии, ишемического инсульта и других тромботических осложнений [1, 2].

Подавление активности тромбоцитов с помощью различных антитромбоцитарных препаратов (антигрегантов) - одно из главных направлений антитромбоцитарной терапии (АТТ). Ацетилсалициловая кислота (АСК) - ингибитор синтеза тромбоксана А2, клопидогрел и другие антагонисты рецептора АДФ P2Y12, а также антагонисты рецептора фибриногена тромбоцитов - комплекса гликопротеинов (ГП) IIb-IIIa успешно используются для лечения и профилактики артериальных тромбозов [3-5].

Исследование агрегации тромбоцитов - главный метод оценки их функциональной активности и мониторирования действия антитромбоцитарных препаратов. Высокая агрегационная активность тромбоцитов и ее недостаточное подавление при лечении антиагрегантами ассоциируется с повышением риска развития тромботических осложнений, в том числе острого коронарного синдрома (ОКС) [5-8].

В настоящей работе мы исследовали факторы, которые могут влиять на агрегационную активность тромбоцитов у больных с ОКС. Изучено влияние следующих показателей: 1) средний объем тромбоцитов (СОТ, стандартный параметр, характеризующий размер тромбоцитов); 2) характеристики главного участника процесса агрегации тромбоцитов - ГП IIb-IIIa (уровень экспрессии на поверхности тромбоцитов и генетический полиморфизм); 3) генетический полиморфизм изоформы цитохрома P450 CYP2C19, участвующей в образовании активного метаболита клопидогрела.

Больные. В исследование включили 147 больных с ОКС - 118 мужчин и 29 женщин, средний возраст 60±11 лет. Все больные находились на лечении в отделе неотложной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ. У 122 больных диагностирован острый инфаркт миокарда с подъемом сегмента ST на электрокардиограмме (ИМпST), у 4 - инфаркт миокарда без подъема сегмента ST (ИМбпST) и у 21 - нестабильная стенокардия. ИМпST диагностировали у больных с типичным ангинозным приступом, сопровождающимся стойким (не менее 20 мин) подъемом сегмента ST в сочетании с повышением уровня маркеров некроза миокарда. Диагноз ИМбпST устанавливали на основании повышения уровня кардиоспецифического тропонина в сочетании как минимум с одним из следующих критериев: 1) типичный ангинозный приступ; 2) новая или предположительно новая депрессия сегмента ST ≥0,1 мВ, и/или инверсия зубца Т >0,1 мВ в 2 смежных отведениях; 3) новая зона нарушения локальной сократимости по данным эхокардиографии. Нестабильную стенокардию констатировали у пациентов с нормальным уровнем кардиоспецифического тропонина в сочетании с соответствующей клинической картиной.

Тромболитическую терапию проводили 58 больным с ИМпST. Чрескожная транслюминальная коронарная ангиопластика и стентирование в 1-е сутки после поступления выполнены 74 больным.

В качестве антиагрегантной терапии все больные принимали АСК (1-е сутки нагрузочная доза 300 мг для больных, которые еще не получали АСК, затем 100 мг/сут) и клопидогрел (в 1-е сутки нагрузочная доза 300-600 мг для больных, которые не получали клопидогрел, затем 75-150 мг/сут). Больные, которым проводили коронарную ангиопластику, получали внутривенные антагонисты ГП IIb-IIIa - монафрам (n=25) или интегрилин (n=2). Кроме антиагрегантов всем больным назначали стандартную терапию, включающую антикоагулянты, β-адреноблокато­ры, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, статины.

Все больные дали информированное согласие на участие в исследование и исследование было одобрено этическим комитетом Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ.

Отбор и обработка образцов крови. Первый отбор образцов крови проводили в 1-е сутки после развития ОКС. По возможности кровь собирали после того, как больные получали нагрузочную дозу АСК (обычно на догоспитальном этапе), но до приема нагрузочной дозы клопидогрела (65 больных). Второй отбор образцов крови проводили на 3-5-е сутки, а третий - на 8-12-е сутки (перед выпиской). У 25 больных отбор крови в некоторых временных точках не проведен в связи тем, что при коронарной ангиопластики они получали внутривенно антагонист ГП IIb-IIIa монафрам. У этих больных кровь собирали не раньше чем через 6 дней после введения препарата, т.е. после окончания его действия на тромбоциты [9]. Кроме того, у отдельных больных не проведены анализы во всех временных точках в связи с госпитальной смертью (n=2), геморрагическим инсультом (n=1), отказом от участия в исследовании (n=4), ранней выпиской на 6-7-е сутки (n=28).

Кровь собирали, используя в качестве антикоагулянта 3,8% цитрат натрия в соотношении кровь/антикоагулянт 9 мл/1 мл. Обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) получали, центрифугируя кровь при 150 g в течение 10 мин при комнатной температуре. После отбора ОТП оставшуюся кровь центрифугировали при 1000 g в течение 20 мин для получения плазмы без тромбоцитов. К осадку, содержащему лейкоциты и эритроциты, добавляли 5% ЭДТА в соотношении 1/10 и замораживали образцы при температуре -70 °С для последующего определения генетических полиморфизмов ГП IIb-IIIa и CYP2C19. Концентрацию тромбоцитов в ОТП и СОТ определяли в гематологическом счетчике АBACUS Junior B («Аbacus», Австрия). Определение концентрации тромбоцитов и СОТ, а также измерения агрегации и определения количества ГП IIb-IIIa (см. ниже) выполняли в течение 1-2 ч после взятия крови.

Агрегация тромбоцитов. Агрегацию тромбоцитов стимулировали АДФ в конечной концентрации 5 и 20 мкмоль и регистрировали стандартным турбидиметрическим методом, анализируя изменения светопропускания суспензии (Т%). Исследования проводили в неразведенной ОТП в анализаторе агрегации БИОЛА («БИОЛА», Россия) при температуре 37 °С и перемешивании со скоростью 800 об/мин. АДФ добавляли к ОТП через 30 с после начала регистрации светопропускания и проводили измерения в течение 4,5 мин после добавления индуктора. При анализе агрегационных кривых определяли максимальный уровень агрегации (T% макс.).

Количество ГП IIb-IIIa. Содержание ГП IIb-IIIa на поверхности тромбоцитов определяли по связыванию меченного ¹²⁵I антитела CRC64 (¹²⁵I-CRC64) против специфичного для комплекса эпитопа в ГП IIb-IIIa [10]. Антитело метили ¹²⁵I и измеряли его связывание с тромбоцитами, как описано ранее [11, 12]. ¹²⁵I-CRC64 в насыщающей концентрации 10 мкг/мл инкубировали с ОТП, предварительно разведенной плазмой до концентрации тромбоцитов 2,5·10⁸/мл в течение 30 мин при температуре 37 °С в отсутствие (общее связывание) или в присутствии 50-кратного избытка немеченого антитела (неспецифическое связывание). Связанную с тромбоцитами и свободную метку разделяли центрифугированием ОТП через 20% раствор сахарозы. Специфическое связывание оценивали как общее минус неспецифическое. Содержание ГП IIb-IIIa рассчитывали как количество молекул связавшегося антитела на 1 тромбоцит.

Определение генетических полиморфизмов ГП IIb-IIIa и CYP2C19. ДНК из образцов крови выделяли с помощью наборов «Проба Рапид Генетика» («ДНК-Технология», Россия). Выделенную ДНК хранили при температуре -20 °С. Генетические варианты ГП IIIa Leu33Pro определяли, используя наборы для полимеразной цепной реакции «Кардио Генетика Тромбофилия» («ДНК-Технология», Россия), а варианты CYP2C19*1/*2 (G681A) и CYP2C19*1/*17 (C806T), используя наборы «SNP-ЭКСПРЕСС-ФАРМАКОГЕНЕТИКА» (ООО НПФ «Литех», Москва, Россия). Для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в обоих случаях использовали детектирующий амплификатор «ДТ-96» («ДНК-Технология», Москва, Россия).

Статистика. Статистический анализ данных проводили с помощью программы Statistica 10.0 for Windows. Параметрическую статистику применяли в случаях, когда распределение переменных удовлетворяло критериям нормальности (тест Шапиро-Вилкса). Во всех других случаях использовали непараметрические тесты: Манна-Уитни - для сравнения независимых переменных, ANOVA по Фридману - для сравнения повторно измеряемых переменных, Спирмена - для оценки корреляционных взаимосвязей. Данные представляли как среднее ± стандартное отклонение.

Агрегация тромбоцитов у больных с ОКС. Агрегацию тромбоцитов, индуцированную 5 и 20 мкмоль АДФ, анализировали в 1, 3-5 и 8-12-е сутки после развития ОКС. В 1-е сутки учитывали измерения, выполненные у 65 больных, которые уже получили АСК, но еще не начали прием клопидогрела. Показатели агрегации у больных, получивших нагрузочную дозу клопидогрела (в большинстве случаев на догоспитальном этапе), не анализировали в связи со значительной вариабельностью эффектов этого препарата в зависимости от времени между его первым приемом и взятием крови, которое у разных больных составляло от 20-30 мин до 10 ч. Средние уровни агрегации тромбоцитов в 1, 3-5 и 8-12-е сутки представлены на рисунке.

СОТ и агрегация тромбоцитов. Показатель СОТ у больных с ОКС варьировал от 6,5 до 11,0 фл, а средние значения в 1, 3-5 и 8-12-е сутки составили соответственно 7,96±0,86 фл (n=105), 8,10±0,90 фл (n=81) и 8,03±0,82 фл (n=85). Анализ различий СОТ с помощью статистического метода, применяемого для повторных измерений (тест ANOVA по Фридману), не выявил достоверных изменений этого показателя (p>0,05) в разных временны'х точках, несмотря на незначительное, но достоверное повышение среднего уровня на 3-5 и 8-12-е сутки по сравнению с таковым в 1-е сутки (p<0,001 и p=0,024). Достоверные положительные взаимосвязи уровней агрегации тромбоцитов и СОТ зарегистрированы в 1-е сутки у больных, которые уже получили АСК, но еще не начали прием клопидогрела. В других временны'х точках (3-5-е и 8-12-е сутки), когда все больные получали не только АСК, но и клопидогрел, подобных корреляций не наблюдалось (табл. 1).

Содержание ГП IIb-IIIa и агрегация тромбоцитов. Количество ГП IIb-IIIa на поверхности тромбоцитов у больных с ОКС варьировало от 31,1·10³ до 73,8·10³ на 1 тромбоцит и не менялось в разные сроки от начала ОКС. Средние значения в 1, 3-5 и 8-12-е сутки составили соответственно (48,3±8,0) ·10³ (n=138), (48,5±7,3) ·10³ (n=99) и (48,2±8,3) ·10³ (n=109) на 1 тромбоцит. Достоверные прямые взаимосвязи содержания ГП IIb-IIIa и уровней агрегации обнаружены в 1-е сутки ОКС у больных, получивших АСК, но не начавших прием клопидогрела. Однако на 3-5-е и 8-12-е сутки на фоне двухкомпонентной АТТ (АСК + клопидогрел) таких корреляций не отмечено (см. табл. 1).

Генетический полиморфизм ГП IIb-IIIa и агрегация тромбоцитов. Агрегацию тромбоцитов сравнивали у больных с ОКС с разными генетическими вариантами рецептора фибриногена тромбоцитов - ГП IIb-IIIa. Анализировали аллельные варианты белка, различающиеся заменой лейцина (Leu) пролином (Pro) в 33-м положении аминокислотной последовательности ГП IIIa - ГП IIIa Leu33Leu, ГП IIIa Leu33Pro и ГП IIIa Pro33Pro. Гетерозиготные и гомозиготные носители более редкого аллеля Pro33 объединены в одну группу. Согласно данным, представленным в табл. 2, мы не обнаружили влияния генетического полиморфизма ГП IIb-IIIa на показатели индуцированной АДФ агрегации во всех изученных временны'х точках и на фоне различной АТТ.

Генетический полиморфизм CYP2C19 и агрегация тромбоцитов. Агрегацию тромбоцитов сравнивали у больных с ОКС с разными гаплотипами (сочетание аллелей) изоформы цитохрома P450 CYP2С19, участвующей в образовании активного метаболита клопидогрела. Проанализировано два основных полиморфизма CYP2C19 - *1/*2 и *1/*17 (однонуклеотидные замены G681A и C806T). Варианты CYP2C19*2 и *17 представляют соответственно медленный и быстрый метаболизаторы клопидогрела (*1 - нормальный, или «дикий», генотип) [13-15]. В подгруппы больных с медленным, стандартным и быстрым метаболизмом клопидогрела включены носители следующих гаплотипов (*2/*2/±*17 и *1/*2/-*17), (*1/*1/-*17 и +*1/*2/+17*) и (*1/*1/+*17) соответственно. Агрегацию сравнивали на 3-5-е и 8-12-е сутки у больных на фоне двухкомпонентной АТТ (АСК + клопидогрел). У носителей медленно метаболизирующего гаплотипа CYP2C19 обнаружено повышение агрегации тромбоцитов, стимулируемой 20 мкмоль АДФ, на 3-5-е сутки после развития ОКС (по сравнению с быстро и стандартно метаболизирующими гаплотипами). При исследовании агрегации на 3-5-е сутки, стимулированной 5 мкмоль АДФ, а также на 8-12-е сутки, стимулированной обеими концентрациями АДФ (5 и 20 мкмоль), достоверных различий между подгруппами с разными гаплотипами CYP2C19 не обнаружено (табл. 3).

В настоящей работе исследовали влияние различных факторов на агрегационную активность тромбоцитов у больных с ОКС. Изучали влияние СОТ, характеристик ГП IIb-IIIа (содержание и генетический полиморфизм) и полиморфизма изоформы цитохрома P450 CYP2C19.

СОТ - стандартный показатель, характеризующий размер тромбоцитов и определяемый при проведении анализов крови в современных гематологических анализаторах. В ряде крупных клинических исследований и в метаанализах показано, что повышенный СОТ является независимым фактором риска развития тромботических осложнений у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями [16-18]. В то же время влияние межиндивидуальных вариаций СОТ на функциональную активность тромбоцитов, в частности на их способность к агрегации, остается практически неизученным. Нами показано, что у больных с ОКС наблюдается прямая корреляция между СОТ, т.е. индивидуальным размером тромбоцитов, и уровнем их агрегационных ответов, стимулированных 5 и 20 мкмоль АДФ. Эти взаимосвязи мы выявили только в 1-е сутки после развития ОКС в подгруппе пациентов, получивших АСК, но еще не начавших прием клопидогрела. На фоне двухкомпонентной АТТ - АСК в сочетании с клопидогрелом (на 3-5-е и 8-12-е сутки) подобных корреляций не наблюдалось. Скорее всего, это объясняется тем, что в этих условиях прием клопидогрела - антагониста рецептора АДФ служит главным фактором, влияющим на уровень индуцированной АДФ агрегации. Клопидогрел является пролекарством и образование его активного метаболита, ингибирующего рецептор P2Y12, происходит в результате сложных метаболических превращений, в которых участвуют эстеразы и несколько изоформ цитохрома P450. Именно в связи с этим антиагрегантное действие клопидогрела характеризуется высокой вариабельностью [4, 5, 13-15, 19]. Таким образом, можно предположить, что при получении больными клопидогрела вариации индуцированной АДФ-агрегации определяются главным образом индивидуальными особенностями действия этого препарата, а не какими-либо другими факторами, в том числе вариациями СОТ.

ГП IIb-IIIa (αIIb/β3-интегрин) является рецептором фибриногена тромбоцитов и главным участником процесса образования тромбоцитарных агрегатов. При воздействии на тромбоциты различных индукторов происходит активация рецепторной функции ГП IIb-IIIa и фибриноген, связываясь с активированным рецептором на разных тромбоцитах, формирует между ними молекулярные связи. Именно эта реакция и служит непосредственной причиной прикрепления тромбоцитов друг к другу и формирования агрегатов [20]. В настоящей работе мы изучали влияние на агрегацию как содержания ГП IIb-IIIa на поверхности тромбоцитов, так и генетического полиморфизма этого рецептора. Мы показали наличие достоверных прямых связей между количеством ГП IIb-IIIa и уровнями агрегации у больных с ОКС. Этот результат подтверждает данные, полученные нами ранее в группе здоровых добровольцах [11, 12] и в меньшей по численности группе больных с ОКС [21]. Как и в случае с СОТ, корреляции между количеством ГП IIb-IIIa и показателями индуцированной АДФ агрегации зарегистрированы лишь в 1-е сутки ОКС у больных, получивших АСК, но не начавших прием клопидогрела. Таких корреляций не обнаружено при приеме АСК в сочетании с клопидогрелом в более поздние сроки от развития ОКС (3-5-е и 8-12-е сутки). Как отмечалось ранее, скорее всего это связано с тем, что при терапии клопидогрелом уровень индуцированных АДФ агрегационных ответов определяется в первую очередь вариабельностью действия этого антагониста рецептора P2Y12 АДФ. При исследовании влияния генетического полиморфизма ГП IIb-IIIa на агрегацию тромбоцитов мы сравнивали больных с разными аллельными вариантами ГП IIIa Leu33Pro. В ряде эпидемиологических исследований, проведенных в том числе в России, показано, что наличие аллеля ГП IIIа Pro33 (20-40% в европейских популяциях) является умеренным фактором риска развития тромботических осложнений [22-24]. В нашей работе мы выделили подгруппы больных с генетическим вариантами ГП IIIa Pro33- (ГП IIIa Leu33Leu) и ГП IIIaPro33+ (ГП IIIa Leu33Pro и Pro33Pro). Мы не обнаружили статистически значимых различий агрегационных ответов между этими подгруппами ни в 1-е сутки на фоне монотерапии АСК, ни на 3-5-е и 8-12-е сутки на фоне терапии АСК с клопидогрелом. Эти результаты хорошо соответствуют нашим данным, ранее полученным при изучении влияния полиморфизма ГП IIIa Leu33Pro на агрегацию тромбоцитов у здоровых добровольцев [11, 12], и данным других авторов, которые также не обнаружили его существенного влияния на активность тромбоцитов и/или рецепторную функцию ГП IIb-IIIa [25, 26].

Ранее в наших собственных исследованиях [27, 28], а также в работе T. Kunicki и соавт. [29] показана прямая взаимосвязь СОТ и количества ГП IIb-IIIa. Можно предположить, что именно повышенное содержание этого рецептора служит одной из причин повышенной агрегационной активности тромбоцитов у пациентов с высоким СОТ (т.е. с крупными тромбоцитами), продемонстрированной в данной работе. В то же время нельзя исключить, что крупные тромбоциты обладают и другими особенностями, усиливающими их способность к агрегации. Из экспериментальных работ по фракционированию тромбоцитов (из отдельных образцов крови человека и животных) известно, что субпопуляции крупных тромбоцитов обладают более высокой функциональной активностью - они не только интенсивнее агрегируют, но и содержат большее количество секреторных гранул, большее количество протромботических гранулярных компонентов и синтезируют больше тромбоксана А2 [30-32]. Возможно, что эти же факторы влияют и на интенсивность агрегационных ответов у лиц с тромбоцитами разных размеров и разным СОТ.

Среди факторов, потенциально способных влиять на агрегационную активность тромбоцитов у больных с ОКС, мы также исследовали генетический полиморфизм изоформы цитохрома Р450 CYP2C19, участвующей в метаболических превращениях клопидогрела в его активный метаболит. Известно, что некоторые генетические варианты этого фермента обладают сниженной (CYP2C19*2), а некоторые повышенной (CYP2C19*17) способностью к метаболизму клопидогрела. Для комплексного анализа влияния этих полиморфизмов целесообразно выделять гаплотипы (сочетания разных аллелей), характеризующиеся высокой, стандартной (или промежуточной) и низкой скоростью образования активного метаболита клопидогрела [13-15, 33]. Нам удалось выявить повышение индуцированной АДФ агрегации у больных с «медленным» гаплотипом CYP2C19. Однако это повышение зафиксировано только на 3-5-е сутки после развития ОКС и начала терапии клопидогрелом и при использовании 20 мкмоль АДФ. В других ситуациях (3-5-е сутки, 5 мкмоль АДФ и 8-12-е сутки, 5 и 20 мкмоль АДФ) достоверных различий не выявлено.

Таким образом, эффекты полиморфизма CYP2С19 проявились на более коротких сроках насыщения клопидогрелом (3-5-е сутки по сравнению с 8-12-ми сутками) и на более высокой концентрации АДФ (20 мкмоль по сравнению с 5 мкмоль), т.е. в условиях наиболее чувствительных (из использованных в работе) для оценки ослабления эффектов клопидогрела. Необходимо отметить, что некоторые особенности и ограничения нашего исследования могли повлиять на выраженность различий между разными вариантами CYP2C19. Во-первых, в исследование включали только больных с ОКС. Во-вторых, все больные, кроме клопидогрела, получали АСК, которая также влияет на индуцированную АДФ-агрегацию тромбоцитов (хотя и не столь специфично и мощно, как клопидогрел). В-третьих, агрегационная активность тромбоцитов проанализирована менее чем у 100 больных и поэтому группа с медленным метаболизмом клопидогрела оказалась малочисленной (n=9 и n=11 на 3-5-е и 8-12-е сутки соответственно). Возможно, именно совокупность этих причин не позволила нам зарегистрировать более выраженные эффекты полиморфизма CYP2C19, продемонстрированные в ряде других работ, сделанных в этой области [8, 13, 15, 33, 34].