Прогностическое значение аллельных вариаций генов, влияющих на систему гемостаза, в развитии антифосфолипидного синдрома и поражения почек у больных системной красной волчанкой

Вторичный антифосфолипидный синдром (АФС) может развиваться у 20-30% больных системной красной волчанкой (СКВ). К основным критериям АФС относятся венозные и/или артериальные тромбозы, акушерская патология (невынашивание в I и II триместрах беременности, преждевременные роды), анемия, тромбоцитопения, поражение кожи (сетчатое ливедо, язвенно-некротические дефекты), поражение нервной системы, сердца, легких и почек. Наиболее убедительными лабораторными маркерами АФС в настоящее время считаются антитела к β2-гликопротеину, волчаночный антикоагулянт, антитела к кардиолипинам (аКЛ) классов IgG и IgM. В ряде случаев прогноз СКВ определяется развитием «катастрофического» АФС, с полиорганной недостаточностью, в основе которой лежат нарушения в микроциркуляторном русле - тромботическая микроангиопатия (ТМА).

Поражение почек - волчаночный нефрит (ВН) развивается у 50-70% больных СКВ. ТМА у больных с АФС вносит дополнительный вклад в поражение почек [1].

У некоторых пациентов изменения, характерные для ассоциированной с АФС нефропатии (АФС-Н), могут доминировать на разных этапах течения ВН. Для АФС-Н характерно сочетание тромботической и фиброзной окклюзии мелких внутрипочечных сосудов, ведущее к развитию ишемического поражения почек. Клинические проявления АФС-Н неспецифичны и представлены артериальной гипертонией, как правило, тяжелой, и нарушением функции почек; мочевой синдром выражен умеренно либо отсутствует [1]. Прогнозировать развитие АФС на основании клинико-лабораторных маркеров сложно. Вместе с тем своевременно начатая терапия антикоагулянтами может заметно улучшить прогноз болезни и предотвратить угрожающие жизни осложнения.

Известно, что риск развития тромботических осложнений увеличивается при наличии дефектов в генах, влияющих на систему гемостаза.

В настоящее время большое внимание уделяется персонифицированному подходу в медицине. Оценка влияния индивидуальных генетических особенностей пациента на риск развития и характер течения заболевания представляется одним из наиболее актуальных вопросов современной науки.

Целью работы стала оценка прогностического значения полиморфизма генов тромбофилии: гена белка противосвертывающей системы крови - ингибитора активатора плазминогена 1-го типа - PAI-1 (4G/5G 675), гена белка свертывающей системы крови - фактора XIII - FXIII (G485T), гена фибриногена - FBG (G(–455)A), генов белков тромбоцитарных рецепторов: гликопротеина Ia - GPIa (C807T) и гликопротеина IIIa - GPIIIa (T196C), а также генов белков, вовлеченных в патогенез дисфункции эндотелия: субъединицы p22phox NADH-оксидазы - p22phox (C242T), эндотелиальной NO-синтазы - eNOS (G894T) и метилентетрагидрофолатредуктазы - MTHFR (С677Т) - для развития клинико-лабораторных признаков АФС и варианта прогрессирования ВН у больных СКВ с АФС.

В исследование включили 100 больных СКВ европеоидной расы, наблюдающихся в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Всего было 80 женщин и 20 мужчин в возрасте от 16 до 73 лет (средний возраст 37±14 лет). Длительность наблюдения составляла для 73 больных более 5 лет, для 18 - от 1 года до 5 лет и для 9 - менее 1 года. Диагноз СКВ устанавливали согласно критериям Американской коллегии ревматологов. Основанием для диагноза АФС служили разработанные и дополненные группой исследователей в 2006 г. клинико-лабораторные критерии [2]. Степень активности СКВ оценивали по шкале SELENA SLEDAI (шкала оценки активности СКВ, дополненная по результатам исследования Safety of Estrogens in Lupus Erythematosus National Assessment - SELENA). В зависимости от наличия клинико-лабораторных признаков АФС все больные разделены на 2 группы. В 1-ю вошли 50 больных СКВ с диагностированным АФС в возрасте от 16 до 68 лет (в среднем 40±13 лет), из них 9 (18%) мужчин и 41 (82%) женщина. Во 2-ю группу включили 50 больных СКВ в возрасте от 18 до 73 лет (в среднем 36±15 лет) без клинико-лабораторных признаков АФС, из них 39 (78%) женщин и 11 (22%) мужчин. Всем больным проводили комплексное обследование, которое включало стандартный набор клинических, лабораторных и инструментальных исследований. Анализ полиморфизма генов проводили на базе лаборатории генных и клеточных технологий кафедры биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова с помощью аллельспецифичной полимеразной цепной реакции и электрофореза в агарозном геле.

Статистическую обработку данных выполняли с помощью пакета программ Statistica 10 и SPSS 14.0. Прогностические модели оценки риска возникновения клинических проявлений АФС разрабатывали с помощью логистического регрессионного анализа. Оценку моделей проводили методом построения ROC-кривых. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

У больных с подтвержденным АФС чаще, чем у пациентов без АФС, встречались микротромбозы, тромбоцитопения, сетчатое ливедо, артериальные и венозные тромбозы, трофические язвы, а также доминировало тяжелое поражение почек: быстро прогрессирующий волчаночный нефрит (БПВН) встречался в 2 раза чаще, чем в отсутствие АФС (табл. 1).

Артериальные тромбозы диагностированы практически только у больных с АФС (за исключением 1 больного). В этой группе мутации гена белка p22phox (C242T) выявлялись чаще, чем у больных без тромбозов. Стандартная ошибка доли мутантных генотипов (ММ - 37%) у больных с артериальными тромбозами составила 10% (табл. 2).

При этом статистически значимых различий по полиморфизму генов белков PAI-1 (–675G), FXIII (G485T), GPIIIa (T196C), eNOS (G894T), MTHFR (C677T), GPIa (C807T), FBG (G(–455)A) не выявлено. Следует отметить, что у единственного больного c артериальными тромбозами в группе без АФС выявлены гетерозиготные генотипы генов eNOS (G894T) и PAI-1 (–675G).

Мутантный аллель гена p22phox (C242T) также чаще выявлялся у больных СКВ и АФС при развитии венозных тромбов (p=0,029). Стандартная ошибка доли мутантных генотипов (ММ - 36%) у больных с венозными тромбозами составила 14%. Среди пациентов с венозными тромбозами не было ни одного с гомозиготным генотипом по мажорному аллелю (табл. 3).

Как и у больных с тромбозами в артериальном русле, статистически значимого различия по полиморфизму других генов белков системы гемостаза не выявлено. Для группы пациентов с СКВ без АФС не удалось провести статистическую оценку частоты манифестации венозных тромбозов в зависимости от аллельных вариантов изучаемых генов в связи малым числом пациентов с данным клиническим признаком (n=3). Важным представляется то, что у больных без АФС с тромбозами в венозном русле имелись от 4 до 6 мутаций в генах, влияющих на систему гемостаза, у всех выявлен гомозиготный генотип по мутантному аллелю гена PAI-1 (–675G), мутантные аллели генов GPIa (C807T) и p22phox (C242T).

При наличии такого клинического признака, как сетчатое ливедо, у больных с АФС статистически значимо чаще обнаруживался полиморфизм гена белка eNOS (G894T) (p=0,019). Стандартная ошибка доли мутантного аллеля (ММ - 15%) составила 9%, отношение шансов (OШ) для частоты мутантного аллеля - 3,8 при 95% доверительном интервале (ДИ) от 1,5 до18,8 (табл. 4).

Значимых различий по частоте мутаций других исследованных генов не отмечено. У больных с сетчатым ливедо без АФС взаимосвязи с полиморфизмом анализируемых генов не обнаружено.

У больных с тромбоцитопенией в рамках АФС статистически значимо чаще встречались мутации гена белка GPIa (C807T) (p=0,028). Стандартная ошибка доли мутантного генотипа (ММ - 33%) у больных с тромбоцитопенией составила 7%, ОШ для частоты мутантного генотипа - 2,49 при 95% ДИ от 1,2 до 28,9 (табл. 5).

Мутации в генах белков PAI-1 (–675G), FXIII (G485T), GPIIIa (T196C), p22phox (C242T), MTHFR (C677T), eNOS (G894T), FBG (G(–455)A) статистически значимо не различались у больных АФС с тромбоцитопенией и без нее.

В группе пациентов без АФС статистически значимых различий по распределению аллей и генотипов анализируемых генов не обнаружено.

Для таких клинических признаков, как микротромбозы и трофические язвы, в исследуемой когорте больных взаимосвязи с изучаемыми полиморфизмами генов не выявлено.

У больных с АФС с быстропрогрессирующим волчаночным нефритом (БПВН) статистически значимо чаще встречались мутации белка MTHFR (C677T) (p=0,038). Стандартная ошибка доли мутантного генотипа (ММ - 30%) у больных с БПВН составила 9%, ОШ для мутантного генотипа - 3,1 при 95% ДИ от 1,4 до 32,7 (табл. 6).

В результате анализа распределения аллельных вариантов генов белков PAI-1 (–675G), FXIII (G485T), GPIIIa (T196C), p22phox (C242T), eNOS (G894T), GPIa (C807T), FBG (G(–455)A) не выявлено различий между больными с СКВ и АФС с БПВН и пациентами без поражения почек или с латентным и медленно прогрессирующим ВН.

В группе больных без АФС не обнаружено взаимосвязи исследуемых полиморфизмов с поражением почек.

Не обнаружено влияния аллельных вариантов генов на возраст дебюта АФС в рамках СКВ.

У больных СКВ и АФС не выявлено статистически значимой связи активности заболевания с полиморфизмом изучаемых генов.

С помощью логистического регрессионного анализа разработаны прогностические модели развития артериальных и венозных тромбозов, тромбоцитопении, БПВН у больных СКВ с АФС (табл. 7, 8).

Проведенное исследование позволяет констатировать, что у большинства больных с АФС определялись мутации в генах, влияющих на систему гемостаза. Так, полиморфизм гена GpIa играет роль в повышении вероятности тромбоцитопении у пациентов с СКВ, осложненной АФС. Возможный механизм данного явления состоит в том, что аКЛ могут проявлять активность агонистов коллагеновых рецепторов тромбоцитов, одной из субъединиц которых является гликопротеин GpIa; полиморфизм (C807T) увеличивает сродство аКЛ к рецепторам коллагена, тем самым увеличивая агрегацию тромбоцитов [3-6]. Разработанная нами прогностическая модель оценки риска развития тромбоцитопении в рамках СКВ, осложненной АФС, включает следующие предикторы: уровень аКЛ IgG, уровень аКЛ IgM, возраст больных и генотип гена GpIa (С807T). Модель оказалась удовлетворительной (площадь под кривой - ППК 81% (больше 50%) и обеспечивает чувствительность 80% и специфичность 78%.

По нашим данным, полиморфизм гена белка субъединицы p22phox (C242T) NADPH-оксидазы оказался статистически значимо связанным с риском развития артериальных и венозных тромбозов у больных СКВ, осложненной АФС. В клетках, экспрессирующих мутантный аллель гена p22phox (C242T), активность продукции кислородных радикалов NADPH-оксидазой значительно выше [7]. При активации NADPH-оксидазы нарушается выработка NO, вазодилатирующая способность NO снижается, в эндотелии сосудов поддерживается оксидантный стресс, происходит структурная перестройка как эндотелия, так и гладких мышечных клеток сосудов [8-10]. Эти факторы могут играть определенную роль в повышении риска развития тромботических осложнений у пациентов с АФС[11].

Созданная нами прогностическая модель оценки риска артериальных тромбозов включает следующие предикторы: уровень аКЛ IgG, уровень аКЛ IgM, генотип изучаемого полиморфизма p22phox (C242T). При анализе методом построения ROC-кривой модель признана удовлетворительной (ППК 78%), чувствительность - 71%, специфичность - 72%. Прогностическая модель оценки риска венозных тромбозов включает возраст пациента, уровни аКЛ IgG, аКЛ IgM, генотип p22phox. Модель признана удовлетворительной (ППК 67%), но не обеспечивающей достаточной чувствительности и специфичности (69 и 50% соответственно).

Важным представляется то, что у больных без АФС с тромбозами в венозном русле имелось от 4 до 6 мутаций в генах, влияющих на систему гемостаза, у всех выявлен гомозиготный генотип по мутантному аллелю гена PAI-1 (–675G), мутантные аллели генов GPIa (C807T) и p22phox (C242T). Возможно, что в рамках СКВ с АФС вклад аллельных вариаций упомянутых выше генов в развитие венозных тромбозов менее значим из-за наличия более весомых факторов риска (волчаночный антикоагулянт, антитела к β2-гликопротеину, аКЛ).

Отмечена зависимость риска проявлений сетчатого ливедо от частоты мутантного аллеля и генотипа гена eNOS (G894T). Считается, что в основе патогенеза сетчатого ливедо лежат функциональные нарушения вазодилатации и констрикции, а также микротромбозы в поверхностных сосудах кожи [12]. При АФС аКЛ дополнительно снижают активность эндотелиальной NO-синтазы [7, 13, 14], из-за чего нарушается дилатационная функция сосудов. Можно предполагать, что в сочетании с мутацией в гене eNOS повышается риск развития микротромбозов сосудов кожи, следовательно, и частота появления сетчатого ливедо у пациентов с СКВ и АФС.

Показано, что у пациентов с мутацией в гене MTHFR (C677T) в более короткие сроки развивается тяжелое поражение почек, характеризующееся снижением фильтрационной способности [15]. У пациентов с СКВ и АФС наличие мутации в гене MTHFR (C677T) также ухудшает прогноз течения ВН. Вероятнее всего, быстрое снижение функции почек связано с вкладом ТМА в развитие нефрита [1]. Разработанная нами прогностическая модель развития БПВН включает следующие предикторы: уровень аКЛ IgG, уровень аКЛ IgM, генотип MTHFR (C677T). Модель признана удовлетворительной (ППК 76%), чувствительность - 72%, специфичность - 74%.

Не обнаружено статистически значимой связи между аллельными вариантами генов PAI-1 (–675G), GpIIIa (T196C), FXIII (G485T), FBG (G(–455)A) и особенностями клинических проявлений АФС. По данным литературы, полиморфизм упомянутых генов повышает вероятность развития тромбозов в артериальном и венозном русле; возможно, что при АФС вклад этих мутаций в патогенез тромботических осложнений не столь значим, как при других патологических состояниях (тромбоэмболия легочной артерии, ишемическая болезнь сердца, гепатокарцинома, острые нарушения мозгового кровообращения) [8, 9, 16, 17].

Высокая распространенность мутантных генотипов и аллелей генов тромбофилии у больных СКВ с АФС позволяет предполагать их важную роль в развитии тромботических осложнений и тромбоцитопении: мутация в гене GpIa (С807T), вероятно, является одним из предикторов развития тробоцитопении в рамках СКВ с АФС. Полиморфизм гена eNOS (G894T) может увеличивать частоту нарушения микроциркуляции крови в органах и тканях у больных СКВ с АФС. Наличие мутантного аллеля гена p22phox (C242T) субъединицы NADPH-оксидазы увеличивает риск развития артериальных и венозных тромбозов у больных СКВ с АФС. Риск развития БПВН у больных СКВ с АФС, вероятно, связан с мутацией в гене MTHFR (C677T). Данные предположения подтверждают разработанные модели оценки риска развития тромбозов, тромбоцитопении и БПВН.