Установление видовой принадлежности фрагментов и частиц поперечно-полосатой мышечной ткани по IgGобщ с помощью количественного твердофазного иммуноферментного анализа

Необходимость определения видовой принадлежности мышечной ткани возникает при назначении судебно-биологических экспертиз по относительно небольшим фрагментам биологических тканей, доставленным с мест пожара, взрыва, при расчленении тел на множество частей, в том числе подвергшихся неблагоприятным воздействиям факторов окружающей среды, а также при исследовании микрочастиц тканей, обнаруженных на орудиях травмы. При этом необходимо отметить, что микрочастицы мышечной ткани обнаруживаются чаще на режущих, колюще-режущих и рубящих предметах в зазубринах, выемках и других дефектах клинка, а также на границе с рукояткой или ограничителем [1].

Для того чтобы определить происхождение поступившего биологического материала, отдельные небольшие фрагменты или частицы, обнаруженные на орудии травмы, подвергают судебно-цитологическому исследованию [2]. Установление наличия мышечной или другой ткани производят по стандартной методике, принятой в судебно-медицинской цитологии, окраску производят разными красителями: растворами атебрина (акрихина), акридинового оранжевого или азура-эозина (рис. 1—3 на цв. вклейке).

Рис. 1. Волокна поперечно-полосатой мышечной ткани, в отдельных ядрах просматривается Х-хроматин.

Акрихин, ув. 600.

Рис. 2. Волокно поперечно-полосатой мышечной ткани.

Акридиновый оранжевый, ув. 600.

Рис. 3. Волокно поперечно-полосатой мышечной ткани.

Азур-эозин, ув. 400.

Для установления видовой принадлежности фрагментов и частиц мышечной ткани в судебно-биологических подразделениях государственных судебно-экспертных организаций применяют традиционные иммунологические методы: реакция преципитации в агаре (РПА), встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ) в агаре или на пленках из ацетата целлюлозы [3—5]. ВИЭФ и РПА, как и все классические иммунологические методы, применяемые для определения видовой принадлежности биологических объектов, основаны на образовании комплекса «антиген—антитело» в виде преципитата. Однако для визуальной регистрации процесса преципитации необходимы относительно высокое содержание белка и достаточно длительное время проведения реакции. При установлении видовой принадлежности фрагментов мышечной ткани применение указанных методов позволяет добиться положительного результата не во всех случаях, что обусловлено их низкой чувствительностью для исследования такого рода объектов.

В зарубежных странах для установления видовой принадлежности биологических объектов по иммуноглобулинам класса G (IgG) с конца XX века и до настоящего времени широко используют метод количественного иммуноферментного анализа (ИФА) [6—10]. В нашей стране были разработаны усовершенствованные варианты этого метода с использованием отечественного тест-набора реагентов для иммуноферментного определения общего IgG человека (IgG_общ) «IgG-общий-ИФА-БЕСТ» [11], а также тест-системы «IgG-общий-ИФА-ХЕМА» (регистрационное удостоверение на медицинское изделие от 05.09.2016 ФСЗ 2007/00335), которая применяется и в клинической практике для диагностики иммунитета. Следует подчеркнуть, что активное внедрение в повседневную практику работы судебно-биологических подразделений судебно-экспертных организаций количественного ИФА является актуальной задачей судебно-медицинской экспертизы, поскольку позволит значительно повысить точность и производительность экспертных исследований [12—16].

Тест-набор «IgG-общий-ИФА-ХЕМА» предназначен для определения IgG_общ (выделяют 4 изотипических подкласса IgG, кодируемых цифрами и обозначаемых как IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4). Подклассы IgG различаются по способности связывать комплемент и активировать его по альтернативному пути, связываться с рецептором к Fc-фрагменту IgG на разных типах клеток и проникать через плаценту. С помощью этого тест-набора можно измерить суммарно в сыворотке крови человека все подклассы IgG.

Принцип метода заключается в том, что в результате количественного твердофазного ИФА образуется специфический иммунный комплекс с использованием иммобилизованных IgG-антител и моноклональных IgG-антител, меченных пероксидазой. Исследуемые IgG в результате анализа оказываются как бы «зажатыми» между молекулами иммобилизованных и меченых антител. Данный комплекс выявляют посредством окраски с помощью раствора тетраметилбензидина (ТМБ), после чего в лунки полистирольного планшета вносят стоп-реагент. Регистрацию результатов реакции осуществляют фотометрически на регистрирующем приборе при длине волны 450 нм.

Для дальнейшего совершенствования способов практического применения количественного твердофазного ИФА в части, касающейся установления видовой принадлежности мышечной ткани по IgG_общ с помощью набора «IgG-общий-ИФА-ХЕМА», требовалась подборка оптимальных значений калибровочных проб.

Цель исследования — совершенствование способа установления видовой принадлежности фрагментов и частиц мышечной ткани по IgG_общ методом количественного твердофазного ИФА с помощью набора «IgG-общий-ИФА-ХЕМА»: определение оптической плотности и концентрации вышеуказанного антигена, подборка оптимальных значений калибровочных проб, проверка специфичности методики.

Материалом исследования являлись фрагменты и частицы мышечной ткани человека (давность взятия образцов от 2 нед до 1 мес, а также высушенные на марле экстракты из крови некоторых животных (собак, птиц, свиней и кошек), необходимые для контроля аналитической специфичности метода и дистиллированная вода (pH 7,4) в качестве отрицательного контроля. Исследование перечисленных образцов производили по методу AA-планшет с иммобилизованными антителами анти-IgG человека, вошер медицинский микропланшетный, шейкер термостатируемый, ридер — аппарат для фотометрического учета результатов реакции с программным обеспечением.

Предварительно фрагменты и частицы измельчали. Из образцов крови животных, высушенных на марле, вырезали фрагменты размером 1×1 см. После чего измельченную мышечную ткань экстрагировали в 150 мкл дистиллированной воды с pH 7,4 при температуре 4 °C в течение 7 сут, кровь животных обрабатывали в течение 18—20 ч при тех же условиях. Экстракты тщательно перемешивали. Далее исследование проводили с применением метода количественного ИФА по стандартной схеме (рис. 4 на цв. вклейке).

Рис. 4. Схема проведения количественного твердофазного иммуноферментного анализа по установлению видовой принадлежности мышечной ткани.

Исследование осуществляли следующим образом: в лунки 96-луночного полистирольного планшета с иммобилизованными антителами анти-IgG человека добавляли по 90 мкл рабочего раствора для разведения сывороток (вытяжек). Затем в лунки добавляли по 10,0 мкл отрицательного контроля (раствор, используемый для экстрагирования вытяжек, и стандартная калибровочная проба 0 мг/мл IgG_общ), по 10,0 мкл стандартных калибровочных проб для расчета концентрации (от 1,00 до 25,00 мг/мл IgG_общ), по 10,0 мкл контрольной сыворотки, содержащей IgG_общ. Время инкубации составляло 30 мин при температуре 37 °C на шейкере. После 7-кратного отмывания на вошере в лунки добавляли по 100 мкл коньюгата (антитела анти-IgG_общ, меченные пероксидазой хрена) и вновь инкубировали в течение 30 мин при температуре 37 °C на шейкере и отмывали с помощью вошера. Образовавшийся комплекс выявляли ферментативной реакцией с использованием раствора ТМБ.

В образцах с заведомо известной концентрацией IgG_общ (в калибровочных пробах, прилагаемых к набору) определяли оптическую плотность, после чего по 6 точкам с помощью программного обеспечения строили калибровочную кривую. Эта кривая являлась основой для последующего определения концентрации IgG_общ в исследуемых пробах. В результате проведенного экспериментального исследования было установлено, что концентрация IgG_общ в экстрактах из фрагментов и частиц мышечной ткани человека составила 2,426±0,135 мг/мл, при этом концентрация IgG_общ в неразведенных водных экстрактах из крови животных являлась весьма незначительной (таблица). Оптическая плотность минимальной калибровочной пробы, от которой осуществляют отсечку положительного результата, составила 0,076±0,014 усл. ед. (концентрация 1 мг/мл), максимальная калибровочная проба — 2,623±0,351 усл. ед. (концентрация 25 мг/мл). Таким образом, в результате проведенного исследования были подобраны оптимальные калибровочные пробы, позволяющие использовать полученные значения в практической работе для установления видовой принадлежности частиц мышечной ткани количественным иммуноферментным методом по IgG_общ с помощью набора «IgG-общий-ИФА-ХЕМА».

Оптическая плотность и концентрация IgG_общ в цельных экстрактах из крови животных, высушенной на марле, и экстрактах из фрагментов мышечной ткани человека, M±m

В результате проведенного исследования был апробирован способ применения количественного твердофазного ИФА для установления видовой принадлежности фрагментов мышечной ткани по IgG_общ, определены показатели оптической плотности и концентрации, а также подобраны оптимальные значения минимальных и максимальных калибровочных проб, необходимых в практической работе. Высокая чувствительность, специфичность и производительность метода ИФА определяют приоритет его применения на этапе установления видовой принадлежности фрагментов мышечной ткани при производстве судебно-биологических экспертиз.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.