Посмертное образование этанола — давняя проблема судебной медицины и, как следствие, вопросы интерпретации результатов исследования трупных биологических объектов долгое время волнуют судебных медиков и подталкивают ученых к поиску эффективных биомаркеров прижизненного приема этанола. Этанол при прижизненном употреблении подвержен довольно быстрому посмертному изменению. Таким образом, старания ученых были обращены на поиски неокислительных метаболитов этанола, которые могут быть маркерами достоверного прижизненного употребления этанола. Среди них первостепенное значение уделяется глюкуронидам, образующимся в процессе глюкуронирования (детоксикации) в легких и печени разных ксенобиотиков, включая этанол. Одним из таких прямых неокислительных маркеров биотрансформации этанола является этилглюкуронид (этил-β-D-6-глюкуронид, ЭтГ), который может быть обнаружен в разных жидкостях и тканях организма [1]. Сегодня ЭтГ широко используется в скрининге и мониторинге, в диагностике и при трансплантации печени [2], а также в популяционных исследованиях. Количественное определение ЭтГ в разных биологических объектах (включая волосы) в последние годы нередко позиционируется как один из самых надежных биомаркеров недавнего приема этанола, даже если он в объектах не обнаруживается [3], в связи с чем ЭтГ был рекомендован для судебно-медицинской экспертизы [4, 5].
Цель работы — обобщить имеющиеся в настоящее время в отечественной и зарубежной литературе аналитические методы определения ЭтГ и представить схематический обзор проблем относительно воспроизводимости и интерпретации результатов исследований на ЭтГ, которые могут ограничивать их применение в судебно-медицинском контексте. При этом задача работы заключалась не в том, чтобы опровергнуть надежность ЭтГ как маркера употребления этанола, а в том, чтобы повысить его достоверность, проанализировать экспериментальные исследования и конкретные случаи из практики для правильной интерпретации результатов тестирования с помощью ЭтГ и предложить направления будущих исследований в целях повышения достоверности метода.
Материал и методы
Для поиска публикаций была использована база данных литературных ресурсов The National Center for Biotechnology Information (NCBI). Поиск осуществляли по ключевому слову «глюкоронид». Всего было найдено более 600 публикаций.
В более ранних работах были описаны возможности использования ЭтГ в качестве маркера при диагностике алкогольной интоксикации [6, 7], в представленной работе был проведен анализ отечественных и зарубежных источников, опубликованных преимущественно за последние 10 лет, которые были посвящены этой теме.
Результаты и обсуждение
Впервые ЭтГ был обнаружен в 1950-х годах в моче кролика [8, 9] и как метаболит этанола ЭтГ описан в 1967 г. [10]. В 1983 г. при хроматографическом определении продуктов метаболизма этанола в срезах легких было установлено образование его метаболита, аналогичного глюкуроновой кислоте, и сделан вывод о том, что легочная система метаболизма этанола является неокислительным процессом, который связан с ЭтГ [11, 12]. После этого началось активное исследование неокислительных маркеров этанола. Одна из первых работ по токсикокинетике ЭтГ у человека по сыворотке крови после употребления этанола была опубликована в 1997 г. [13]. На сегодняшний день спектр объектов исследования на ЭтГ весьма широк: кровь и сухие пятна крови, моча и сухие пятна мочи, слюна, липиды пота и поверхности кожи, стекловидное тело и синовия, волосы и ногти, меконий, пуповина и плацента [14].
Этилглюкуронид образуется почти сразу после принятия небольшого количества этанола (в моче его концентрация выше, чем в крови) [15] и обнаруживается в период от 6 ч до 4 сут после последнего приема; предполагаемая его доля в процессе биотрансформации этанола составляет, по разным данным, от 0,02—0,06 до 0,6—1,5% от принятой дозы [16—18]. Базисной методикой определения ЭтГ является жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ-МС/МС) с пределом обнаружения 0,1 мг/л, которая модифицируется в зависимости от поставленных целей и решаемых задач [19—21].
Достоинства исследования на ЭтГ методом ЖХ-МС/МС (максимальная чувствительность и специфичность) могут быть его же недостатком, поскольку ЭтГ может быть обнаружен в объектах в очень низких концентрациях и дать положительный результат после воздействия этанола из иных источников, не связанных с алкогольными напитками, что может привести к ложноположительной интерпретации исследований. Выявлено, что источники, включающие в себя даже незначительное количества этанола, могут быть многочисленны. Это косметические средства и парфюмерные изделия, жидкости для полоскания рта и средства личной гигиены, некоторые пищевые продукты, дезинфицирующие средства и содержащие этанол лекарственные средства при местном их применении и многие другие, в том числе ингаляционное воздействие паров этанола и этанолсодержащих дезинфицирующих средств [22—24].
Анализ обширной базы литературных источников [25—33] показал, что большая часть исследований связана с выявлением истинных положительных результатов. Однако возможна доля ложноотрицательных результатов, которые могут быть получены как вследствие естественной биодеградации ЭтГ, так и при гниении. Так, в эксперименте in vitro было установлено, что ЭтГ в крови нестабилен и может деградировать во время гниения в образцах при 30—40 °C без консервантов, но остается стабильным с консервантом (фторидом калия) при комнатной температуре, в связи с чем отрицательный результат, особенно в случаях сильного гниения, следует интерпретировать с осторожностью [25].
Однако в недавно проведенном исследовании [26] ЭтГ не был выявлен ни в одном виде дистиллированных алкогольных напитков, независимо от типа спирта (ром, джин, водка, виски, морс, кукурузный бренди, кордиал) или ликера. Также он не был обнаружен ни в одном образце пива, включая пильзнер, вайсбир, лагер и эль разного происхождения. При этом ЭтГ был обнаружен в каждом из 42 проанализированных образцов вина. Самые высокие количества его содержались в красном вине и колебались от 1425 до 3720 мкг/л. Более низкие концентрации ЭтГ присутствовали в белом вине (от 347 до 1685 мкг/л) и игристом вине (от 281 до 1447 мкг/л). Таким образом, было показано, что вино является внешним источником ЭтГ. Этот факт следует учитывать при тестировании биомаркеров, особенно при анализе волос, которые наиболее чувствительны к внешнему загрязнению. Результаты исследования продемонстрировали, что определяемый биомаркер в миллиграммах может содержаться в бутылке вина [26].
Все более распространенным методом проверки факта употребления этанола становится тестирование на ЭтГ. В последние годы стали внедряться коммерческие иммунотесты на ЭтГ, гарантирующие абсолютную избирательность и достоверность результата при низких пороговых уровнях определения маркера (0,1 мг/мл) [27—29]. Однако при скрининге на отсутствие этанола очень важно знать частоту ложноотрицательных и ложноположительных результатов. Считают, что результат тестирования мочи на ЭтГ будет положительным в течение 48—72 ч после употребления этанола, поэтому «80-часовой тест на этилглюкуронид» стал устойчивым выражением в сообществе специалистов, тестирующих наличие алкоголя. Ранее было проведено исследование с использованием имеющихся в продаже наборов ЭтГ. Все образцы мочи, собранные более чем через 26 ч после употребления этанола, показали ложноотрицательные результаты, в связи с чем был сделан вывод о нецелесообразности использования этого коммерческого теста для скрининга употребления этанола [30, 31] и значительном снижении чувствительности теста после первых суток приема этанола [32].
Наряду с этим имеется достаточно доказательств ложноположительных результатов иммунологического скрининга ЭтГ по экскреции разных спиртовых глюкуронидов (гомологов ЭтГ). Положительный результат иммуноферментного анализа на ЭтГ может и не быть связан с употреблением этанола. Описан случай ложноположительного скрининга иммуноферментного анализа мочи DRI EIA EtG (Thermo Fisher Scientific Microgenics) после самолечения хлоралгидратом, который был подтвержден отрицательным результатом ЭтГ по методу ЖХ-МС. В этой связи авторы рекомендуют положительные результаты иммуноанализа ЭтГ всегда подтверждать более специфичным методом, таким как ЖХ-МС/МС [33].
О необходимости контролировать положительные результаты иммуноанализа ЭтГ, если пациент отрицает прием этанола, с помощью масс-спектрометрии, заявляют ряд авторов [34—38], что также может быть актуально в связи с широко распространенной в период пандемии COVID-19 обработкой рук дезинфицирующими средствами на основе спиртов. В частности, описаны ложноположительные результаты иммуноанализа DRI EIA EtG с использованием рекомендованного производителем порогового значения 0,5 мг/л, вызванные наличием пропилглюкуронидов в моче после использования дезинфицирующего средства для рук на основе пропанола. При контрольных исследованиях с участием сотрудников лаборатории ложноположительные результаты иммуноанализа до 4 мг/л были получены после обычного использования дезинфицирующего средства, а также после пассивного вдыхания паров дезинфицирующего средства (до 0,89 мг/л). Результаты иммуноанализа были положительными даже после 4-кратного использования дезинфицирующего средства (до 0,14 мг/л) и до 6 ч после последнего контакта с ним (максимум 0,63 мг/л для пользователей дезинфицирующего средства) и 0,25 мг/г после пассивной ингаляции этого средства при работающей вытяжке в лаборатории [34]. Аналогично риск получения ложноположительных результатов при использовании иммуноанализа DRI EIA EtG подтвержден и для трихлорэтилглюкуронида из препарата хлоралгидрата и 1-пропилглюкуронида, применяемых как средства для дезинфекции рук на основе пропанола, что свидетельствует о перекрестной реакции глюкуронидов алифатических короткоцепочечных спиртов (пропилового и бутилового) с иммуноферментным анализом ЭтГ [35]. Также имеется описание случая ложноположительного иммунологического скрининга ЭтГ вследствие избыточного выделения с мочой изопропилглюкуронида у пациента, злоупотреблявшего промышленными моющими средствами, при положительном скрининге ЭтГ с помощью иммуноанализа (установлена концентрация около 860 мг/л при судебно-медицинском пороговом значении 0,1 мг/л и клиническом пороговом значении 0,5 мг/л); анализ ЖХ-МС/МС на ЭтГ был отрицательным (<0,05 мг/л). Отсюда следует, что использование бытовых и промышленных химикатов с короткоцепочечными алифатическими спиртами следует рассматривать как потенциальный источник ложноположительных результатов иммуноанализа ЭтГ [36]. Еще одним подтверждением опасности получения ложноположительного результата иммунотеста является случай ложноположительного результата иммуноанализа у больного с политоксикоманией при употреблении трет-бутанового и трет-амилового спирта как замены этанола. При исследовании с помощью ЖХ-МС/МС (пороговое значение 0,1 мг) получены положительные результаты на трет-бутилглюкуронид, 2-бутилглюкуронид и 2-пропилглюкуронид. Причиной ложноположительного результата в этом случае также является перекрестная реакция гомологов ЭтГ [37], что не свидетельствует в пользу высокой избирательности и чувствительности иммуноферментного тестирования с помощью ЭтГ.
С начала пандемии COVID-19 дезинфицирующие средства для рук на спиртовой основе стали одной из мер первой линии защиты от передачи коронавирусной болезни. В связи с этим вопрос о том, можно ли обнаружить биомаркеры этанола в образцах после всасывания этанола другими путями, кроме перорального, представляет большой интерес. Установлено, что из-за частого использования в течение длительного периода времени высокопроцентного спиртосодержащего дезинфицирующего средства возможна пероральная, кожная или легочная его абсорбция, выявляемая при исследовании на ЭтГ [38].
При этом возникает вопрос: является ли вдыхание или чрескожная резорбция дезинфицирующего этанола основной причиной положительных результатов ЭтГ после проведения дезинфекции рук? При проведении экспериментального исследования использовали средство для обработки рук Desderman pure (содержащее 96% этанол и 2-пропанол) для многократной дезинфекции рук без и под вытяжкой. Имитируя обычный рабочий день в клинике, 5 сотрудников лаборатории использовали это средство 32 раза в течение 8 ч, а 2 участника подвергались воздействию его паров без кожного контакта. Мочу собирали на исходном уровне и с интервалом 1 ч (до 24 ч) после первого использования дезинфицирующего средства и проводили ЖХ-МС/МС образцов. По результатам исследования было установлено, что этанол из дезинфицирующих средств для рук в основном поступает через дыхательные пути, а не через кожу. Это может вызвать отчетливую экскрецию ЭтГ и, следовательно, истинноположительные результаты определения ЭтГ в моче у лиц, не употребляющих этанол, что следует учитывать при оценке применения ЭтГ в качестве маркера недавнего употребления этанола [39, 40].
Убежденность в том, что наличие ЭтГ коррелирует с прижизненным употреблением этанола и не может образоваться спонтанно у умерших, тела которых подвержены гниению или имеют премортальную диабетическую гипергликемию, не всегда оправдана [41]. Следует учитывать, что не только спиртовые глюкурониды (гомологи ЭтГ) могут быть причиной ложноположительных результатов употребления этанола. Ложная идентификация приема этанола может быть результатом синтеза ЭтГ бактериями в моче. При изучении образцов мочи с подтвержденным ростом Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae или Enterobacter cloacae при хранении образца в условиях комнатной температуры в присутствии этанола было установлено, что при этом образовывались высокие концентрации ЭтГ (24-часовой диапазон 0,5—17,6 мг/л) в 35% зараженной E. coli моче, содержащей этанол. Наряду с этим в некоторых образцах, которые изначально были положительными на ЭтГ из-за недавнего употребления этанола, ЭтГ оказался чувствителен к деградации в результате бактериального гидролиза. Отсюда следует, что бактериальные патогены в моче способствуют последующему синтезу ЭтГ из этанола и, как следствие, отмечается клинический ложноположительный результат. Таким образом, можно сделать важный вывод о том, что присутствие ЭтГ в моче не является уникальным маркером недавнего употребления этанола, а может быть результатом синтеза в инфицированых E. coli образцах, содержащих эндогенный этанол. С учетом связанных с этим рисков ложной идентификации потребления этанола и ложноотрицательных результатов ЭтГ из-за бактериальной деградации, необходимо подтверждение результатов иными методами [42]. При нестабильности ЭтГ в моче по отношению к бактериальной деградации и синтезе ЭтГ в загрязненных образцах, для стабилизации ЭтГ можно использовать имеющиеся рекомендации по консервированию образцов азидом калия, который ингибирует расщепление ЭтГ кишечной палочкой [43]. Также с целью минимизации возможных ошибок вследствие бактериального гидролиза и биодеградации ЭтГ опробован метод сбора образцов мочи на фильтровальную бумагу для ингибирования бактериальной активности. Результаты исследования с помощью ЖХ-МС/МС сухих пятен мочи на бумаге при хранении в условиях комнатной температуры показали отсутствие бактериальной деградации при хранении [44].
Наряду с этим следует учитывать, что положительный результат исследования мочи на этанол при отсутствии ЭтГ в моче не является свидетельством перорального употребления этанола, но может быть следствием эндогенного образования этанола в моче на фоне глюкозурии [45].
Относительно вопроса последствий тестирования на ЭтГ после приема «безалкогольного» пива следует заметить, что в ряде стран (включая Россию) такие напитки могут содержать до 0,5% этанола без обязанности декларирования. При проведении эксперимента с употреблением 2,5 л «безалкогольного» пива на человека с помощью метода ЖХ-МС/МС было установлено наличие ЭтГ в высоких концентрациях в моче — 0,30—0,87 мг/л, что выше применяемого порогового значения для доказательства отказа от приема этанола 0,1 мг/л, при этом этанол в крови и моче отсутствовал [46].
Также следует акцентировать внимание на установленной экспериментально значительной индивидуальной вариабельности экскреции ЭтГ с мочой, что предполагает осторожность при использовании измерения ЭтГ в моче в судебно-медицинской практике [47]. На концентрацию ЭтГ оказывает влияние и масса тела: более высокие концентрации ЭтГ отмечаются у лиц с высоким индексом массы тела (ИМТ ≥25 кг/м2) по сравнению с лицами, имеющими низкий ИМТ (<25 кг/м2), в широком диапазоне уровня потребляемого этанола, что также необходимо учитывать при интерпретации полученных результатов ЭтГ [48].
Заключение
Анализ изученных литературных источников показал, что использование в судебно-медицинской практике данных исследования биологических объектов (в частности, мочи) на ЭтГ в качестве маркера употребления этанола не является универсальным методом и его результаты зачастую зависят от влияния на органим человека как внешних, так и внутренних факторов, включая наличие бактериальных патогенов в моче. При использовании данного метода необходимо учитывать вероятность получения ложного результата и не трактовать его как безусловное подтверждение или опровержение факта приема этанола с учетом показателя доказательного порога употребления этанола 0,1 мг/л в моче. Так, в случае употребления безалкогольного пива при отсутствии этанола в крови и моче определяется ЭтГ в моче в диапазоне 0,3—0,87 мг/л.
Следует также отметить, что в связи с повсеместным распространением применения дезинфицирующих средств в период пандемии коронавирусной инфекции существенно увеличивается вероятность ложноположительного результата приема этанола при тестах на ЭтГ.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.