Основным морфологическим признаком посмертных изменений является аутолиз органов и тканей, в том числе печени, описанию которого был посвящен представленный ранее анализ данных литературы об ультраструктурных и гистологических изменениях печени в зависимости от давности наступления смерти [1].
В то же время развитие посмертного аутолиза закономерно приводит к изменениям гистохимических, молекулярно-биологических и всех других характеристик ткани печени [2, 3]. Последние, так же как и структурные нарушения, с одной стороны нивелируют диагностику прижизненно развившихся патологических процессов и заболеваний, а с другой — могут быть использованы для определения длительности посмертного периода.
Цель работы — анализ данных литературы о посмертных изменениях ткани печени и использовании их для определения давности наступления смерти.
Материал и методы
В основу работы положен анализ научных публикаций, представленных в базах данных eLibrary и National Center for Biotechnology Information (PubMed и PubMed Central). Поиск осуществляли по ключевым словам «давность смерти», «печень», «посмертные изменения». Дополнительные источники были выбраны из списков литературы анализируемых статей. В обзоре представлены данные о гистохимических, молекулярно-биологических, микробиологических и лучевых методах исследования печени, отражающих посмертные ее изменения и используемых для определения давности смерти.
Результаты и обсуждение
Приступая к анализу гистохимических и молекулярно-биологических изменений ткани печени, развивающихся после смерти, следует указать, что наряду с процессами посмертного аутолиза в органах и тканях отмечается активация процессов апоптоза (запрограммированной гибели клеток), обусловленная гипоксией [4].
Согласно данным литературы [4, 5], выделяют два основных сигнальных пути апоптоза: внутренний (митохондриальный) и внешний. В качестве активаторов внутреннего пути могут выступать свободные радикалы, повреждения ДНК и гипоксия [5]. Внешний путь обусловлен взаимодействиями, индуцируемыми специфическими рецепторами, относящимися к суперсемейству генов рецепторов фактора некроза опухоли [6].
В этой связи представляют интерес посмертные изменения экспрессии генов, связанных с апоптозом, в печени мышей в зависимости от давности их гибели (от 3 до 24 ч): каспазы 3 (Casp3), Bcl2, Bax и Trp53 [7]. Уровень экспрессии Casp3 повышался, а Bcl2 понижался при увеличении длительности посмертного периода, уровень экспрессии Bax повышался с 3 до 18 ч с последующим снижением через 24 ч после смерти, экспрессия Trp53 увеличилась через 3 и 6 ч, а затем (с 9 до 24 ч после смерти) снижалась [7—29]. По данным A. Halawa и соавт. [8], посмертная экспрессия кодирующих апоптоз генов в печени крыс была значительно повышена через 3 и 6 ч после смерти по сравнению с их показателями в момент смерти.
При сравнительном изучении проапоптотических и антиапоптотических генов в печени 4 пациентов, погибших в результате ишемической болезни сердца или огнестрельного ранения, было установлено снижение уровней антиапоптотических генов (BAG3, BCL2, BAK1, BAX, BIRC5, IL10, NAIP, NFKB1, RIPK2) и негативных регуляторов апоптоза (BCL10, BCL2L2, BCL2, CD40LG, CIDEA), а также повышение экспрессии проапоптотических и положительных регуляторных генов апоптоза (ABL1, AIFM1, CIDEB, PYCARD, TNFRSF10B) и генов каспаз (CASP3, CASP4, CASP9) через 16 и 48 ч после смерти по сравнению с показателями экспрессии генов через 6 ч после смерти [9]. Таким образом, после наступления смерти отмечается превалирование проапоптотических сигналов над антиапоптотическими механизмами, запускающее каспазозависимый путь развития апоптоза клеток печени.
Примечательно, что посмертная деградация РНК происходит быстрее, чем ДНК и белков [10]. При этом в клетках печени РНК остается жизнеспособной в течение 2 ч после смерти при 37 °C и 16 ч при 4 °C [11], что позволяет ее использовать в качестве потенциального маркера ранних посмертных изменений.
Кроме того, было показано, что микроРНК, являющиеся малыми некодируемыми молекулами РНК длиной 18—25 нуклеотидов, более стабильны в качестве эталонных генов по сравнению с другими типами РНК после смерти и, соответственно, в меньшей степени изменяются в посмертном периоде и зависят от условий внешней среды [12]. Критическая оценка потенциала использования микроРНК в диагностике давности наступления смерти представлена в аналитическом обзоре А.А. Халикова и соавт. [13]. В результате сравнительного исследования с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени посмертных изменений различных типов РНК в органах взрослых самцов мышей BALB/c на протяжении 8 сут после их гибели было установлено, что наиболее стабильными для печени являются так называемые кольцевые РНК, в частности, гены LC-Ogdh и circ-AFF1 [14].
Вышеприведенные посмертные морфологические изменения клеток печени закономерно сопровождаются нарушениями их биохимического состава. Так, при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии внутренних органов, включая печень, у крыс было установлено увеличение концентрации продуктов распада аденозинтрифосфата по мере увеличения длительности посмертного периода [15]. Содержание миоглобина, установленное иммуноферментным методом, незначительно увеличивалось в ткани печени 3 кроликов-самцов на 5-е сутки после их гибели и было существенно повышенным через 7 и 14 сут [16].
Линейная зависимость между длительностью посмертного периода и активностью малатдегидрогеназы (МДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) была отмечена и в исследовании T. Gos и соавт. [17] при изучении фрагментов ткани печени, полученных от 25 трупов (4 женщин и 21 мужчины в возрасте 6—69 лет) и хранящихся на протяжении 14 сут после смерти. При этом активность МДГ оказалась более стабильной по сравнению с ЛДГ, что, по мнению авторов [17], обусловлено защитным влиянием митохондриальных мембран на посмертную активность ферментов, поскольку ЛДГ локализуется исключительно в цитоплазматической фракции, а МДГ присутствует в цитоплазматической и митохондриальной фракциях.
Особого внимания заслуживает изучение посмертного содержания γ-гидроксимасляной кислоты, которая с начала 90-х годов прошлого столетия стали использовать в качестве наркотика. При помощи метода газовой хроматографии — масс-спектрометрии K. Sakurada и соавт. [18] установили прогрессирующее увеличение ее содержания в печени 5 мышей в динамике посмертного периода: 0,8±1,0, 4,7±1,5 и 8,8±0,8 мкг/г через 3, 24 и 48 ч после их гибели соответственно. В печени живых мышей γ-гидроксимасляная кислота не определялась, равно как и в печени живых пациентов, не употребляющих наркотики. В образцах же ткани печени, взятых через 5 ч — 7 сут после смерти больных, содержание γ-гидроксимасляной кислоты варьировало от 2,6 до 12,0 мкг/г [18].
К сожалению, согласно данным литературы, посмертная динамика изменений большинства исследованных биохимических показателей в ткани печени носит волнообразный характер, что затрудняет их внедрение в практику судебно-медицинского определения давности смерти. Так, в результате биохимического анализа активности ферментов гомогенатов ткани печени 24 взрослых самцов мышей Swiss, находившихся в течение 48 ч после гибели в помещении при температуре 22±2 °C, J. Paltian и соавт. [19] выявили, что активность каталазы — фермента антиоксидантной системы, участвующего в защите клеток от окислительного стресса, сразу после гибели составляла 23,14±4,25, через 2 ч — 25,80±4,53, а через 24 ч и 48 ч — 22,68±1,17 и 28,18±0,84 соответственно. Аналогично активность δ-аминолевулинатдегидратазы, участвующей в биосинтезе гема как компонента простетических групп гемоглобина и цитохромов, в момент гибели составляла 30,7±3,72, через 2 ч — 7,67±1,29, а через 24 и 48 ч — 12,7±0,43 и 0,43±0,19 соответственно [19]. Активность глутатион S-трансферазы, осуществляющей детоксикацию ксенобиотиков, снизилась на 37% через 6 ч после гибели мышей, а через 24 и 48 ч занимала промежуточное положение между исходными значениями (в момент гибели) и при 6 ч длительности посмертного периода [20].
Подобные разнонаправленные изменения содержания разных биохимических компонентов клеток и тканей, обусловленные процессами посмертного аутолиза, считаются основной причиной ограничения применения гистохимических и иммуногистохимических методик при исследовании аутопсийного материала. Показано, что развитие посмертного аутолиза может явиться как причиной полного отсутствия реакции, так и ложноотрицательных и ложноположительных результатов. Установлено, что при анализе иммуногистохимических препаратов ткани печени с антителами KL1 (маркер эпителия желчных протоков) отчетливая положительная реакция отмечалась лишь в 8 (80%) из 10 образцов в наблюдениях с давностью смерти от 1 до 3 сут и в 2 (20%) из 10 образцов с давностью от 3 до 7 сут; во всех наблюдениях с длительностью посмертного периода от 3 до 7 сут и 2 нед и более холангиоциты не окрашивались [2].
В этой связи для предотвращения артефактного окрашивания и определения посмертно измененных биохимических показателей, в частности ткани печени, рекомендуется проведение ранних вскрытий, по крайней мере, в патолого-анатомической практике [21, 22]. Действительно, именно благодаря проведению ранних, в пределах 1—1,5 ч после констатации смерти, вскрытий нами были установлены изменения гистоэнзиматического профиля гепатоцитов [23] и клеток Купфера разных зон печеночных ацинусов при перитоните различного генеза [24].
Перспективными методами изучения аутопсийного материала, в том числе для определения посмертных изменений и давности наступления смерти, являются инфракрасная микроспектроскопия [25] и матричная лазерная десорбционная/ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS) [46]. Инфракрасная микроспектроскопия позволяет определить молекулярно-химический состав с учетом локализации непосредственно на образцах неокрашенных тканей.
В связи с этим P. Huang и соавт. [26] использовали метод инфракрасной микроспектроскопии с оценкой красной и оранжевой зон и гистологической визуализацией для анализа посмертных метаболических процессов и корреляций спектральных и гистологических изменений в печени 30 самцов крыс Sprague-Dawley сразу и через 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144 и 168 ч после их гибели и хранения в камерах с температурой 10, 20 или 30 °C. В результате проведенного исследования образцов ткани печени авторы установили высокую корреляцию между изменениями распределения цвета полос и их интенсивностью, а также между распределением цвета и изменением интенсивности полос с выраженностью процессов аутолиза. В частности, красная и оранжевая области полосы поглощения на 2925 см–1, свидетельствующая о нарушениях связей между CH2-групп основных липидов, повысилась при увеличении длительности посмертного периода. А красно-оранжевая область поглощения 1080 см–1, возникающая преимущественно из-за симметричных и валентных колебаний фосфодиэфирных групп нуклеиновой кислоты, уменьшалась в динамике посмертного периода. При этом, по данным инфракрасных изображений, хранение тел погибших крыс при более высоких температурах приводило к более выраженным посмертным изменениям, а более низкие температуры уменьшали их выраженность [26].
Использование MALDI-TOF MS позволяет при помощи получения масс-спектров провести одновременное картирование сотни пептидов и белков с отражением их локализации в анализируемом срезе ткани с разрешением порядка 50—75 мкм [27]. При исследовании белков и пептидов C. Li и соавт. [28] наблюдали уменьшение интенсивности пиков равных 1364,038, 1461,061 и 1492,089 масса/заряд в ткани печени крыс и 3197,037, 3233,081 и 3359,019 масса/заряд в ткани печени человека при увеличении длительности посмертного периода
Также одним из посмертных проявлений у трупа является миграция бактерий из кишечника в кровь и ткани тела как элемент закономерного развития процессов гниения. В этой связи актуальным является выяснение закономерностей посмертной бактериальной миграции, в частности, особенностей, порядка и времени поражения органов, для эффективной диагностики прижизненных инфекционных поражений органов при патолого-анатомическом вскрытии. С другой стороны, знание временны́х закономерностей бактериальной миграции может способствовать более точному определению давности наступления смерти при судебно-медицинском вскрытии.
Так, в 1993 г. S. Wilson и соавт. [29] высказали предположение, что миграция бактерий через слизистую оболочку кишечника в кровь и внутренние органы может развиваться по мере увеличения времени после смерти. H. Carpenter и R. Wilkins [30] сообщили о выявлении бактерий через 18 ч после смерти организма в 40% образцов крови. Однако в 2006 г. J. Morris с соавт. [31] на основании данных литературы сделали вывод об отсутствии выраженной посмертной бактериальной миграции, если после смерти тело хранится надлежащим образом, а также о том, что длительность посмертного периода оказывает лишь незначительное влияние на скорость распространения бактерий. В 2010 г. M. Weber и соавт. [32] указали, что более длительный посмертный интервал не связан ни с увеличением частоты положительных микробиологических культуральных исследований, ни с увеличением частоты выявления полимикробных культур.
В свою очередь, S. Tuomisto и соавт. [33] при целенаправленном бактериологическом изучении ткани печени, полученной в результате судебно-медицинских вскрытий 33 погибших мужчин, выявили, что в первые 5 сут после смерти (при условии хранения трупов при температуре 4 °С) в 64% наблюдений печень оставалась стерильной, а при длительности посмертного периода 7 сут стерильность снизилась до 40% за счет выявления моно- и мультикультур. При этом, по данным ПЦР-исследования в реальном времени, стерильность была значительно меньше, в том числе за счет увеличения частоты выявления кишечных бактерий (Clostridium spp., Enterobacter spp., Bifidobacterium spp. и Bacteroides spp.), которые не поддаются культивированию [33].
Аналогичные данные были получены в эксперименте при изучении микроорганизмов с помощью MALDI-TOF в печени мышей сразу и через 3, 7, 10 и 16 сут после их гибели [34]. Сразу после гибели ткань печени была стерильна. Спустя 3 сут в печени были обнаружены бактерии Enterococcus spp., которые доминировали в течение последующего посмертного периода исследования, что авторы объяснили близостью печени к кишечнику [34].
Говоря об анализе посмертных изменений, необходимо остановиться и на возможностях посмертной лучевой визуализации этих процессов. Так, все более широкое и активное внедрение посмертных лучевых исследований в практику патолого-анатомических и судебно-медицинских вскрытий [35, 36] явилось поводом для анализа неспецифических посмертных изменений и использования их для определения давности наступления смерти. Итогом таких исследований явилось описание трупных гипостазов в легких, седиментации клеток крови в полостях сердца и просвете аорты, уплотнения стенок аорты и крупных сосудов, дилатации правых отделов сердца, сглаживания границ между серым и белым веществом головного мозга, увеличения объема жидкости в плевральных полостях [37, 38].
В единичных работах отражена лучевая семиотика и посмертных изменений печени. Так, в рамках проекта Virtopsy при посмертной МРТ в 35 (79,5%) из 44 наблюдений были выявлены внутренние гипостазы в легких и в 10 (23%) случаях — в печени в виде нечеткого гипоинтенсивного слоя на Т2-ВИ [39]. Согласно результатам собственных посмертных МРТ-исследований тел 62 умерших новорожденных, хранившихся в холодильной камере при 4 °C в положении лежа на спине, более высокая частота выявления вертикального градиента (выше- и нижерасположенных областей) интенсивности сигнала в печени зарегистрирована на Т1-ВИ по сравнению с Т2-ВИ. При этом его выраженность возрастала при увеличении длительности посмертного периода [40], а изменения соотношения интенсивностей сигнала на Т1- и Т2-взвешенных изображениях легли в основу разработанного нами способа определения давности смерти [41].
В то же время при проведении диффузионно-взвешенной МРТ тел 14 новорожденных (7 мальчиков и 7 девочек, средняя масса тела 2,625 г) с давностью смерти от 1 до 12 сут не было обнаружено зависимости изменений коэффициента диффузии от длительности посмертного периода [42]. Своеобразный вывод был сделан и S. Shiotani и соавт. [43] на основании посмертной МРТ печени 22 умерших больных (16 мужчин и 6 женщин, средний возраст 56,3 года), тела которых до лучевой визуализации хранились в холодильнике при температуре 4 °C (средняя ректальная температура 17,6 °C) от 7 до 96 ч (среднее время 27,7 ч). В результате проведенного исследования время релаксации ткани печени в Т2-режиме коррелировало с ректальной температурой, а в режиме Т1 не имело значимых корреляций. Длительность же посмертного периода, по мнению авторов [43], не влияла на время релаксации ткани печени в Т1- и Т2-режимах.
Заключение
Таким образом, наступление биологической смерти влечет за собой развитие процессов посмертного аутолиза, проявляющихся не только нарушениями структуры клеток и ткани печени, но и изменениями биохимических, гистохимических и иммуногистохимических показателей, а также бактериальной миграцией. Определение и оценку развивающихся посмертных изменений следует использовать как для дифференциальной диагностики с прижизненно развившимися патологическими процессами, так и для определения давности наступления смерти. Выявление вышеописанных посмертных изменений возможно лишь при наличии соответствующих реактивов и/или специального оборудования, что, несомненно, ограничивает применение ряда методов в повседневной практике. Тем не менее проведение, например, посмертных лучевых исследований позволяет визуализировать не только неспецифические посмертные изменения, но и установить широкий ряд прижизненно развившихся патологических процессов и заболеваний, в том числе явившихся первоначальной причиной смерти.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.