В последние годы возросла необходимость судебно-химических и химико-токсикологических исследований [1, 2], в том числе в регионах с большими расстояниями между населенными пунктами и отсутствием транспортной инфраструктуры (дороги, ж/д сообщение и т.п.). Это повышает потребность в материалах и средствах для транспортировки биологического материала без соблюдения температурного режима (2—4 °C) и без использования дополнительного оборудования, медицинских изделий (контейнер для биоматериала и т.п.). В медицине широко применяются карты для забора и транспортировки биологического материала, однако в судебно-медицинской экспертизе для проведения судебно-химического и химико-токсикологического исследований они не распространены в связи с отсутствием в доступной научно-практической литературе данных по их применению, эффективности и удобству с целью выполнения задач, поставленных перед экспертами.
Карта для забора и транспортировки биологического материала позволяет хранить образцы при комнатной температуре, обеспечивает высокую воспроизводимость результатов анализа. Образцы для нанесения на карту: цельная кровь, буккальный эпителий, моча. Область применения: анализ «сухого пятна» методами ИФА, полимеразной цепной реакции (ПЦР), LC-MS. Забор материала в виде сухих пятен широко используется для проведения идентификации личности, лекарственного мониторинга, фармакотоксико-кинетических, доклинических, клинических исследований.
Зопиклон — (RS)-6-(5-хлор-2-пиридил)-7[4(4-метилпиперазин-1-ил)карбонилокси]-5,6-дигидропироло[3,4-b]пиразин-5-он) — снотворное средство, агонист бензодиазепиновых рецепторов. Относится к классу циклопирролонов, но не является производным бензодиазепина. Зопиклон проявляет фармакологические свойства, присущие производным бензодиазепина, а также обладает некоторыми барбитуратоподобными свойствами [3]. В организме человека зопиклон метаболизируется до двух основных метаболитов — зопиклон-N-оксида и N-дезметилзопиклона, поэтому именно эти метаболиты определяли в исследуемом биологическом объекте.
В повестку ряда заседаний Международного комитета по контролю наркотиков (29,33) были включены вопросы, связанные со злоупотреблением зопиклоном, обсуждались данные о привыкании к нему и возникновении неблагоприятных реакций на этот препарат. В России зопиклон включен в список сильнодействующих веществ, утвержденный постановлением Правительства РФ от 29.12.07 №964 [4].
Цель исследования — изучить возможность использования карт для забора и транспортировки биологического материала при проведении судебно-химического и химико-токсикологического исследований на примере мочи, содержащей зопиклон, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии—масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС) высокого разрешения (ВР) с использованием технологии Orbitrap.
Материал и методы
Исследовали действующее вещество зопиклон лекарственного препарата Имован (П№015904/01-290920) после очистки от вспомогательных веществ. Получен рабочий стандартный образец (РСО) — раствор зопиклона с концентрацией 1 мг/мл в 95% этиловом спирте.
Использовали карты для забора и транспортировки биологического материала (КЗТБМ) РУ №РЗН 2017/6431 от 03.11.17, ТУ №9398-001-63802255-2016. Карта представляет собой пластину из высококачественной целлюлозной фильтровальной бумаги Whatman 903 размером 10×10 см с 5 кругами диаметром 10 мм каждый, прикрепленной к бланку для внесения данных пациента.
Объектом исследования служила моча как основной объект при проведении химико-токсикологического анализа [5, 6]. Мочу собирали утром натощак у пациентов (мужчин и женщин в возрасте 26—39 лет), принимавших зопиклон в терапевтических концентрациях по назначению врача. Забор проб биологической жидкости производили неинвазивным способом, добровольно с согласия пациентов и на анонимных условиях.
Мочу исследовали двумя способами пробоподготовки для получения сравнительных данных: первый — использовали нативную мочу с последующим разбавлением, второй — с помощью КЗТБМ.
Применяли метод ВЭЖХ-МС ВР на приборе — масс-спектрометре Orbitrap Exploris 120 MS с источником ионизации при атмосферном давлении (ИАД) для высокопроизводительных задач масс-спектрометрии (МС) с жидкостной хроматографией (ЖХ) [7—9]. Данное оборудование позволяет на современном научно-практическом уровне проводить лабораторную диагностику (обнаружение) наркотических, психотропных и сильнодействующих веществ [10, 11].
Пробоподготовка биологических объектов является одной из важных частей судебно-химического и химико-токсикологического исследований. В зависимости от правильно подобранных условий можно избежать получения ложноположительных данных и добиться достоверного результата [12—15].
Пробоподготовка. Экстракция из нативной мочи (ЭНМ). Взятую от пациентов мочу для имитации оптимального времени начала химико-токсикологического и судебно-химического исследований хранили в течение 1 сут в прохладном месте (при температуре 8—15 °C). Через 1 сут после забора мочи отбирали пробу объемом 100 мкл и добавляли к ней 400 мкл метанола. Встряхивали на шейкере в течение 1 мин, центрифугировали в течение 5 мин при 3500 об/мин. Отбирали 100 мкл этого раствора и добавляли 100 мкл воды. Полученный раствор анализировали методом ВЭЖХ-МС ВР.
Экстракция из круга КЗТБМ (ЭКЗТБМ). Мочу объемом 25 мкл микрошприцем наносили на круг, давали высохнуть при комнатной температуре в течение 30 мин и хранили в прохладном месте 1 сут (для имитации транспортировки и хранения при температуре 8—15 °C). Затем вырезали круг по краю линии на КЗТБМ, помещали его в пробирку Эппендорф и добавляли метанол до зеркала (0,5—1,0 мл). Настаивали в течение 10 мин и встряхивали на шейкере 1 мин, центрифугировали 5 мин при 3500 об/мин. Отбирали 1/2 часть полученного раствора, упаривали его до сухого остатка в токе теплого воздуха с использованием фена. Сухой остаток растворяли в 50 мкл метанола, добавляли 450 мкл воды и анализировали полученный раствор.
Условия хроматографирования при ВЭЖХ-МС ВР. Программное обеспечение — Termo Scientific Xcalibur 4.4; колонка TF Accucore PhenylHexyl column (100×2,1 мм; 2,6 мм), температура колонки 30 °C.
Подвижную фазу использовали в градиентном режиме. Она состояла из подвижной фазы A — 2 мМ раствор аммония формиата в 0,1% водном растворе муравьиной кислоты (pH 3,0) и подвижной фазы B — 2 мМ раствор аммония формиата в 0,1% муравьиной кислоты в смеси ацетонитрил-метанол (1:1). Скорость потока 0,5 мл/мин. Градиентный режим представлен в табл. 1.
Таблица 1. Градиент подвижной фазы
| Время, мин | Скорость потока подвижной фазы, мл/мин | Фаза A, % | Фаза B, % |
| 0 | 0,5 | 99,0 | 1,0 |
| 1,0 | 0,5 | 99,0 | 1,0 |
| 10,0 | 0,5 | 1,0 | 99,0 |
| 11,5 | 0,5 | 1,0 | 99,0 |
| 12,0 | 0,5 | 99,0 | 1,0 |
| 13,5 | 0,5 | 99,0 | 1,0 |
| 15,5 | 0,5 | 99,0 | 1,0 |
Детектирование проводили в режиме информационно зависимой фрагментации. Параметры сканирования: разрешение Orbitrap 60000; диапазон сканирования 100—1000 m/z; RF Lens 60%; автоопределение времени инжекции ионов в ловушку; порог интенсивности для фрагментации 1.0e4. Режим исключения ионов осуществляли после получения одного спектра за 6 с. Более быстрое разделение может привести к получению ложноотрицательных результатов ввиду низкой скорости сканирования, а существенное повышение скорости сканирования повлечет за собой значительное падение интенсивности сигналов. Вследствие отсутствия потерь в процессе соударительной ионизации применение указанного режима сканирования позволяет добиться максимальной чувствительности, что важно при оценке временных окон обнаружения.
Фрагментация: окно изоляции 2 m/z; энергия диссоциации 15, 30 и 45%; разрешение для фрагментов 30 000. Система оснащена источником ионизации с параметрами: тип ионного источника H-ESI; напряжение электроспрея — положительная ионизация 3500 V; напряжение электроспрея — отрицательная ионизация 2500 V; распыляющий газ — азот 50 отн. ед., вспомогательный газ — азот 13 отн. ед. Температура капилляра 280 °C; температура испарителя 350 °C. Встроенная подстройка массы — EASY-IC (флуорантрен).
Для надежной идентификации по результатам анализа использовали следующее программное обеспечение и библиотеки масс-спектрометрической информации: TRACEFINDER 5.1 SP1; TOXFINDER 1.0; EFS_HRAM_Compound_Database; Toxicology_HRAM_Compound_Database; Thermo Scientific mzVault HRAM MS/MS spectral library; COMPOUND DISCOVERER 3.1; MzCloud.
Результаты и обсуждение
На рис. 1 и 2 представлены хроматограммы идентифицированных зопиклон-N-оксида и N-дезметилзопиклона.
Рис. 1. Хроматограмма метаболитов зопиклон-N-оксида (а) и N-дезметилзопиклона (б) при использовании метода экстракции ЭНМ.
Рис. 2. Хроматограмма метаболитов зопиклон-N-оксида (а) и N-дезметилзопиклона (б) при использовании метода экстракции ЭКЗТБМ.
На рис. 1 видно, что использование различных методов экстракции из мочи зопиклона и его метаболитов не влияет на их обнаружение; отличие состоит в наличии сопутствующих пиков (табл. 2).
Таблица 2. Результаты хроматографирования методом ВЭЖХ-МС ВР экстрактов мочи при использовании различных методов пробоподготовки
| Вещество | Элементная композиция | Время удерживания метаболита, мин | Наличие и время удерживания дополнительных пиков, мин | ||
| ЭНМ | ЭКЗТБМ | ЭНМ | ЭКЗТБМ | ||
| Зопиклон-N-оксид | C17H17ClN6O4 | 4,48 | 4,47 | 1,96; 4,14; 4,58 | — |
| N-дезметилзопиклон | C16H15ClN6O3 | 4,12 | 4,12 | 4,76; 8,94; 9,53; 9,97—9,99 | 8,92—8,95; 9,17; 9,53; 9,96—9,99; 12,14 |
При обоих методах пробоподготовки одинаково достоверно можно обнаружить метаболиты зопиклона в моче. Совместное сочетание этих методик пробоподготовки с методом анализа ВЭЖХ-МС ВР позволяет проводить обнаружение исследуемых веществ с высокой степенью надежности.
Время удерживания метаболитов N-дезметилзопиклона и зопиклон-N-оксида составляет 4,12±0,36 и 4,47±0,50 мин соответственно (n=6).
Провели статистическую обработку полученных данных и валидационную оценку (табл. 3) по параметрам «оценка переноса аналита», «определение интерференционных эффектов», «подавление/повышение ионизации» [16].
Таблица 3. Оценка параметров валидационных характеристик при идентификации зопиклона и его метаболитов методом ВЭЖХ-МС ВР с использованием пробоподготовки мочи методом ЭКЗТБМ
| Параметр | Результат |
| Оценка переноса аналита | Переноса аналита для 10 нг/мл не наблюдается |
| Определение интерференционных эффектов | Не наблюдается интерференционных эффектов внутри группы лекарственных препаратов — метаболитов других агонистов бензодиазепиновых рецепторов (клобазам, залеплон, феназепам) |
| Подавление/повышение ионизации | От –4,8 до 2,1%; RSD ˂14% |
Из данных табл. 3 видно, что параметры валидационных характеристик соответствуют критериям приемлемости.
Выводы
1. На примере мочи, содержащей зопиклон, показано, что использование карт для забора и транспортировки биологического материала по сравнению с применением в судебно-химическом и химико-токсикологическом анализах нативной мочи в качестве объекта исследования позволяет также достоверно обнаруживать токсиканты.
2. Предложена методика пробоподготовки при использовании карт для забора и транспортировки биологического материала на этапе забора, хранения и транспортировки мочи, содержащей зопиклон, с последующим обнаружением зопиклона и его метаболитов в моче методом ВЭЖХ-МС ВР.
3. С положительным результатом проведена валидация методики по параметрам «оценка переноса аналита», «определение интерференционных эффектов», «подавление/повышение ионизации»
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.