Проблема определения возраста неопознанного человека до сих пор представляет собой область большого научного интереса исследователей [1—3]. Причина этого — отсутствие единого подхода к определению возраста, который отвечал бы всем требованиям судебно-медицинской практики отождествления личности. Метод должен быть достаточно точен и универсален, а методика — простой и легковоспроизводимой во всех судебно-медицинских учреждениях. Процедура установления возраста не должна занимать слишком много времени или ресурсов [4].

Оценка возрастных изменений костей и стоматологического статуса человека давно используется в судебно-медицинской практике [5, 6]. Наибольшую актуальность исследование этих тканей приобретает в случаях фрагментации тел и выраженных посмертных изменений [7, 8].

В настоящее время одним из наиболее надежных методов определения возраста по зубам является исследование аминокислотного состава твердых тканей зуба [9]. Установлено, что в течение жизни человека в его зубах с постоянной скоростью происходит трансформация L-аспарагиновой и некоторых других аминокислот в D-изомер (рацемизация аминокислот). Зная константу скорости рацемизации, можно вычислить возраст зуба и соответственно возраст его обладателя.

В мировой литературе отсутствует подробное описание методики аналитического исследования аминокислотного состава зуба. В единичных работах зарубежных ученых показано, что биологический возраст коррелирует с ln (1+D/L) или ln{(1+D/L)/(1-(D/L)}, где (D/L) — соотношение D- и L-форм аспарагиновой кислоты твердых тканей зуба, однако цифровые значения показателя сильно различаются [1, 9—11]. Данное обстоятельство послужило поводом для собственного исследования: разработать стандартизованную процедуру получения образцов твердых тканей зуба и провести их хроматографическое изучение.

Цель исследования — разработка методики установления форм аспарагиновой кислоты в твердых тканях зуба человека для последующей оценки их возрастной динамики. Задачи исследования включали определение параметров подготовки образцов зубной ткани для аналитического исследования и хроматографический анализ производных энантиомеров аспарагиновой кислоты в твердых тканях зуба, а также разработку стандартизованного подхода к изучению биохимического состава зубов человека.

Для исследования выбрали здоровые коренные зубы, удаленные у пациентов стоматологических клиник в возрасте от 20 до 50 лет для исправления окклюзии либо после механической травмы. Все доноры зубов дали письменное согласие на исследование. Всего отобрали 5 зубов, чтобы из одного зуба изготовить несколько образцов. От доноров женского пола в возрасте 20, 23, 23 и 35 лет получили 4 премоляра, от донора мужского пола 50 лет — один моляр. До начала подготовки образцов зубной ткани донорский материал хранили в условиях пониженной температуры (3 ^оC) во избежание дополнительной термоиндуцированной рацемизации аминокислот.

Подготовка проб для хроматографического исследования включает очистку зубов, получение образцов твердой ткани, их взвешивание, гидролиз и дериватизацию аминокислот. После механической очистки от крови, слюны и мягких тканей зубы погрузили на 1 ч в водный раствор натрия гипохлорита (NaOCl) с содержанием активного хлора 12% для уничтожения бактерий и примесей, способных повлиять на результат хроматографии. Отмытые дистиллированной водой и просушенные до постоянной массы зубы измельчили в ступке пестиком, а затем разделили на необходимое количество образцов.

Гидролиз измельченных тканей зуба проводился 6 М метанольным раствором HCl в течение 12 ч при комнатной температуре (21 ^оС). Для получения полного деривата аспарагиновой кислоты после гидролиза использовали один из трех дериватизирующих агентов: трифторуксусный ангидрид, хлорид пентафлюоробензоила и хлорид 3,5-бис (трифлюорометил)бензоила.

Хроматографическое исследование проводили на газовом хроматографе Agilent 6850 с использованием хиральной колонки с фазой 20% циклодекстрина в метилполисилоксане (35% фенил) Agilent CP-Chirasil-20 beta 19091 GB233 (30 м × 0,25 мм 0,25 мкм) и масс-селективным детектором 5973N (тип детектора квадрупольный, температура квадруполя 150 °C, ионного источника 230 °С), режим работы детектора устанавливали по стандартной программе AUTOTUNE. Градиентное хроматографирование согласно заданным условиям, температура инжектора 210 °C, ввод пробы в режиме «splitless», газ-носитель — гелий, температура интерфейса 230 °C, задержка 3 мин, интервал сканируемых масс в скрининге 29—550 m/z.

Исследование проводили в два этапа. На 1-м этапе вычисляли массу образцов, достаточную для достоверного результата на хроматограмме. Для этого из тканей двух зубов доноров в возрасте 23 лет изготовили по 5 проб массой 5, 10, 50, 100 и 200 мг. На 2-м этапе с учетом полученных результатов из зубов от доноров 20, 35 и 50 лет изготовили по 6 проб, которые разделили по 2 образца для каждого дериватизирующего агента. Также приготовили 3 пробы из смеси чистых D- и L-аспарагиновой кислоты (Sigma-Aldrich) в качестве стандарта. С использованием стандартов в SCAN-режиме изучили масс-спектры полных дериватов D- и L-аминокислот и получили интенсивность сигналов ионов в зависимости от отношения массы к заряду (m/z). В связи с относительно низким содержанием в зубной ткани изучаемых веществ для идентификации сформировали SIM-режим и провели поиск дериватов в анализируемых образцах зубной ткани по основным характеристическим ионам.

Формы аспарагиновой кислоты по приведенной методике обнаружили во всех пробах, однако пробы, отобранные в количестве 5 мг, оказались недостаточно информативными при хроматографическом исследовании. Пробы по 10, 50, 100 и 200 мг на хроматограммах динамически различались между собой в наглядности и информативности. В ходе 1-й части исследования выяснили, что наилучший ответ на хроматограмме демонстрируют образцы с большим количеством дентина в пробе. Именно поэтому в дальнейшем при измельчении зуба выбирали в ультрафиолетовом свете только фрагменты дентина в количестве 10 мг.

В результате хроматографического разделения получили данные о времени выхода дериватов аспарагиновой кислоты: 8,171 мин для L-аспарагиновой и 8,317 мин для D-аспарагиновой с достоверным разделением пиков на хроматограмме (рис. 1).

По масс-спектрам производных аспарагиновой кислоты, образующихся в ходе дериватизации, вычислили характеристические ионы ее дериватов: m/z 159, 102 (осн), 88 для диметилового эфира аспарагиновой кислоты; m/z 173, 155 (осн), 117 для диизобутилового эфира аспарагиновой кислоты; m/z 189, 130 (осн), 116, 98 для диметилового эфира N-диметил аспарагиновой кислоты; m/z 189, 130, 116 (осн), 98 для диметилового эфира N-метил аспарагиновой кислоты. Указанные массы облегчают обнаружение пиков искомых веществ на хроматограмме и существенно повышают точность исследования при изучении тканей зуба (рис. 2).

В процессе дальнейшей оптимизации методики изучили различные варианты пробоподготовки. Основная методика изготовления образцов твердых тканей зуба для исследования аминокислотного состава заключается в обработке 6 М раствором хлористоводородной кислоты (HCl), при этом гидролиз проходит в течение 12 ч при температуре 110 ^оС [9—11]. После гидролиза кислоту удаляют в роторном испарителе либо под вакуумом, улавливая щелочью (NaOH). Отметили, что изменение концентрации хлористоводородной кислоты как в сторону концентрирования, так и в сторону разбавления в процессе гидролиза приводит к резкому снижению извлечения (процент выхода) аминокислот из дентина зуба. В то же время использование 6 М раствора хлористоводородной кислоты в метаноле позволило снизить температурный режим гидролиза, так как длительное температурное воздействие в агрессивной среде не только индуцирует процесс рацемизации аминокислот, но и снижает хроматографическую «чистоту» исследуемого образца, что может оказать существенное влияние на точность установления биологического возраста. Оптимальные результаты гидролиза достигнуты при температуре 37 ^оС в течение 6 ч и без температурного воздействия (при комнатной температуре 21 ^оС) при воздействии в течение 12 ч. Для экспресс-исследования в случае массового поступления образцов допустимо брать навеску дентина не менее 20 мг и проводить гидролиз при температуре 50 ^оС в течение 2 ч. Для растворения стандартов D- и L-форм аспарагиновой кислоты использовали метанольный раствор хлористоводородной кислоты (HCl) в соотношении 9 частей спирта и 1 часть концентрированной HCl. В указанных условиях протекает процесс частичной дериватизации по карбоксильным группам аспарагиновой кислоты, что облегчает ее хромато-масс-спектрометрическое исследование. Установлено, что стандарты аминокислот труднее растворимы при повышении атомности спирта (от метилового до бутилового), и для их полного растворения требуется нагревание, что является нежелательным и должно быть минимальным по времени.

По результатам исследования определили возможность использовать аминокислотный состав дентина для установления возраста человека в условиях стандартной биохимической лаборатории. Газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией позволяет определять стереоизомеры аспарагиновой кислоты, содержащиеся в твердых тканях зуба. Сведения об обнаруженных особенностях аминокислот в тканях зуба отсутствуют как в отечественной, так и в зарубежной литературе. С учетом установленных нами стандартов пробоподготовки и параметров хромато-масс-спектрометрического анализа методика оценки степени рацемизации аспарагиновой кислоты является легковоспроизводимой. Это позволяет рекомендовать ее для исследования возрастной динамики биохимического состава зубов человека.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.