Памяти заслуженного деятеля науки РСФСР, доктора биологических наук, профессора Марии Дмитриевны Швайковой

В 2017 г. исполняется 40 лет с момента разработки на кафедре токсикологической химии Первого Московского медицинского института (I ММИ им. И.М. Сеченова) схемы скрининга отдельных групп токсикологически значимых лекарственных средств с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ-скрининг), регламентированных приказом Минздрава СССР № 1021 от 25.12.73, обязывающим систематически проводить судебно-химический анализ биологических объектов. Скрининг (от англ. screening — просеивание, отбор) — система методических приемов, позволяющих выбрать научно обоснованную последовательность операций, в результате которых поэтапно «отсеиваются» группы соединений и отдельные вещества. Работу выполнила асп. Г.М. Родионова под руководством зав. каф., засл. деятеля науки РСФСР, д-ра биол. наук, проф. М.Д. Швайковой и доц. Б.Н. Изотова [1].

В качестве инструментального метода для осуществления скрининга токсикологически значимых веществ была выбрана хроматография в тонком слое сорбента как наиболее экспрессный, чувствительный и селективный метод, отвечающий всем требованиям предварительного химико-токсикологического анализа.

Разработку ТСХ-скрининга проводили по двум направлениям:

— подбор оптимальных хроматографических условий для группового (I этап) и частного (II этап) разделения токсикологически значимых «нелетучих» веществ. В качестве общей системы растворителей для веществ кислого, нейтрального и слабоосновного характера была предложена система хлороформ—ацетон (9:1); для веществ основного и слабоосновного характера — общая система растворителей ацетон—хлороформ 25% аммиак—диоксан (5:45:2,5:47,5);

— составление схемы последовательного (комбинированного) применения реагентов общего назначения (I этап) с параллельным использованием специфических (частных) реагентов (II этап).

Для веществ кислого и нейтрального характера:

— общегрупповые реагенты: УФ-свет — раствор сульфата ртути (II) + 0,1% раствор дифенилкарбазона — t °С — 10% раствор хлорида железа (III) — реактив Драгендорфа — реакция Браттона—Маршала;

— частные реагенты: 1% раствор ванилина в метаноле (обнаружение мепробамата).

Для веществ основного и слабоосновного характера:

— общегрупповые реагенты: УФ-свет — 10% раствор хлорида железа (III) — 57% раствор хлорной кислоты и 0,5% раствор нитрита натрия (97:3) — реактив Драгендорфа — реакция Браттона—Маршала;

— частные реагенты — 1% раствор подкисленного йодплатината, реактив Марки, смесь концентрированных серной и азотной кислот (1:1), Н₂SO₄, кристаллы бихромата калия в концентрированной серной кислоте.

Система ТСХ-скрининга разработана для 18 лекарственных веществ кислого, нейтрального и слабоосновного характера и 36 лекарственных веществ основного и слабоосновного характера. Впервые система применена к такому сложному биологическому материалу, каким являются внутренние органы трупа (печень, почки, желудок, кишечник). Показано влияние соэкстрактивных веществ, а также биогенных аминов, эндогенных оснований и других соединений, образующихся в процессе путрификации биоматериала на ранних стадиях хранения.

Скрининг является ведущим диагностическим тестом в затруднительных случаях клинической диагностики, к которым относятся коматозные состояния, случаи комбинированного приема лекарств, подозрения на отравление.

В 1980 г. ТСХ-скрининг медикаментозных отравлений в детской токсикологии был разработан Н.И. Кузнецовой и Б.Н. Изотовым [2]. В данном методе в круг анализируемых веществ входят наиболее распространенные при детских отравлениях лекарственные препараты: производные барбитуровой кислоты, пиразолона, фенотиазина, 1,4-бензодиазепина, алкалоиды, трициклические антидепрессанты. Объектом скрининга является моча.

ТСХ-скрининг лекарственных веществ проводится в 2 этапа:

I — по нативным соединениям (основной);

II — по метаболитам (частный, для токсикантов, подвергающихся в организме значительному метаболизму – производным 1,4-бензодиазепина).

По первому направлению экстракты, полученные при pH 1,0—2,0, хроматографируют в системе растворителей хлороформ—ацетон (9:1); экстракты, полученные при pH 10,0—11,0 в системе этилацетат—метанол—25% аммиак (170:20:10). Неподвижная фаза — силикагель Л.С. Обнаружение токсикантов кислого, нейтрального, слабоосновного и основного характера на хроматограмме проводят последовательной обработкой общегрупповыми реагентами.

Второе направление используется в случае, если в процессе первого направления обнаружили бензодиазепины.

Отрицательный результат скрининга в сочетании с клиническими и аналитическими данными позволяют сделать заключение об отсутствии анализируемых веществ в объекте исследования. Положительный результат является предполагаемым и требует применения подтверждающих тестов для дифференциальной диагностики.

В 1982 г. В.А. Карташов [3] предложил систему ТСХ-скрининга веществ кислого и основного характера, изолированных из биоматериала с помощью ацетона. Согласно предложенной схеме, экстракты, полученные при изолировании, хроматографируют в общих системах растворителей: ацетон—н-гексан—диэтиламин (10:10:1) для веществ кислого характера и ацетон для веществ, обладающих основными свойствами. Экстракты наносят в виде полосы на специально приготовленные пластинки из силикагеля КСК. Для обнаружения веществ кислого характера используют раствор сульфата ртути (II); УФ-свет (254 и 360 нм) и реактив Драгендорфа — для токсикантов основного характера. На основании окраски пятна и значения Rf токсикант относят к одной из трех хроматографических зон (для веществ кислого характера) и одной из шести зон (для веществ основного характера). Для подтверждения полученных результатов применяют частные реакции и физико-химические методы.

В настоящее время в системе оказания помощи при острых отравлениях в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского ТСХ-скрининг проводят на госпитальном этапе в рамках экспресс-диагностики на вещества, подлежащие обязательному исследованию (приказ Минздрава России № 9 от 08.01.02).

Результаты скрининга являются ведущими в диагностике биосред больных, употреблявших алкалоиды группы опия (морфин, кодеин), амфетамины (амфетамин, метамфетамин), производные барбитуровой кислоты, 1,4-бензодиазепина, фенотиазина (групповая идентификация), амитриптилин, димедрол, лепонекс.

ТСХ-скрининг в обращенно-фазовом варианте (ОФТС) разработан в конце 80-х годов XX века на кафедре токсикологической химии Пермской государственной фармацевтической академии для создания более прочной неподвижной фазы путем введения в силикагель гидрофобного компонента — алкильной фазы С2 («Сорбтон-2») и С3 («Плазмохром»). Это обеспечивает более надежное и последовательное использование детектирующих реагентов: раствор хлорида железа (III), раствор сульфата ртути (II) и дифенилкарбазона (вещества кислого характера); фурфурол, подкисленный йодплатинат (вещества нейтрального характера); раствор нингидрина, серная кислота, реактивы Драгендорфа, Марки, Манделина (вещества основного характера).

Основной проблемой проведения скрининга токсикологически значимых соединений на основе ТСХ является зависимость получаемых результатов (величина Rf, окраска пятна) от множества факторов (объективных и субъективных). В связи с этим дальнейшее развитие скрининга токсикантов на основе ТСХ идет по пути повышения чувствительности, унификации процесса и условий хроматографирования.

Первым шагом в этом направлении явилось создание системы Toxi-Lab, а позднее Varian (США), обеспечивающей полную унификацию и стандартизацию скрининговых операций [4, 5].

Комплексная система Toxi-Lab сочетает пробоподготовку объекта (моча) с последующим определением веществ кислого, нейтрального и основного характера из групп опиатов, фенотиазинов, 1,4-бензодиазепинов, каннабиноидов, галлюциногенов, а также кокаина.

Химико-токсикологический анализ более 700 токсикантов и их метаболитов осуществляется на готовых пластинках с нанесенными метками в специальных хроматографических камерах с использованием частных химических реагентов и идентификационных атласов. Сегодня система Toxi-Lab благодаря своей надежности, экспрессности и чувствительности применяется в судебной экспертизе для определения наркотических веществ и их метаболитов, в пробах посмертной мочи и мочи живых людей, в ветеринарии для определения допинга в моче лошадей на бегах, в химико-токсикологическом анализе (ХТА) острых отравлений.

Помимо хроматографии в тонком слое сорбента, для скрининга лекарственных, наркотических и психотропных веществ в ХТА широко применяются высокочувствительные иммунохимические методы [6]. Они основаны на принципах классических методов иммунохимического анализа, описанных впервые в конце XIX века П. Эрлихом, Ж. Борде, К. Ландштейнером и 2 раза отмеченные Нобелевскими премиями в конце XX века (1977 — Yalow, Berson; Kohler, Milstein — 1984).

Из современных иммунохимических методов для экспрессной скрининг-диагностики биологических жидкостей (кровь, моча, слюна) используют иммунохроматографический анализ (ИХА), называемый также «стрип-тест», Quiсk Strip dipstick, экспресс-тест, тест-полоски и т. д. Принцип тонкослойной хроматографии положен в основу ИХА, где роль неподвижной фазы выполняет тест-полоска с иммобилизованными искусственными антигенами (подобные анализируемым токсикантам) и нанесенными на линию старта антителами, строго подобранными к антигенам и связанными с красителями. В качестве подвижной фазы выступает исследуемая биологическая жидкость.

Интерпретация полученного результата осуществляется по наличию (отрицательный результат) или отсутствию (положительный результат) окрашивания в тест-зоне.

Различные фирмы, выпускающие тест-полоски, предлагают полоски как на отдельные группы наркотических веществ, так и мультитесты на 3 или 5 групп одновременно.

Тест-полоски позволяют выявить в моче (слюне) отдельные группы токсикантов: опиаты, тетрагидроканнабинол, амфетамин и метамфетамин, производные барбитуровой кислоты, 1,4-бензодиазепина, трициклические антидепрессанты, а также кокаин, метадон, фенциклидин, экстази.

Тест-кассеты предназначены для определения в слюне опиатов, тетрагидроканнабинола, амфетамина и метамфетамина, производных 1,4-бензодиазепина, кокаина.

Чувствительность определения наркотических и психотропных веществ иммунохимическими методами составляет от 50 до 500 нг/мл [7].

Высокая чувствительность, групповая специфичность, простота использования, невысокая стоимость, возможность исследования большого количества проб одновременно без специальной пробоподготовки делают ИХА (согласно приказу Минздравсоцразвития № 346н от 12.05.10) обязательным в ходе предварительного ХТА.

С помощью ИХА любой человек (школьник, студент, военнослужащий, родители и т. д.) может провести предварительное экспресс-исследование во внелабораторных условиях. Это чрезвычайно актуально в сложившейся наркологической ситуации в стране и мире. Тест-системы используют при медицинских исследованиях, тестировании лиц, подозреваемых в употреблении наркотических веществ и психотропных средств, допинг-контроле, а также в профилактических целях.

Развитие аналитического приборостроения и компьютерных технологий позволяет применять аппаратурные хроматографические методы в качестве скрининговых, обычно направленных на исследования внутри одной группы токсичных веществ, поскольку принципы разделения и идентификации в газовой (газо-жидкостной, ГЖХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) обеспечивают работу с веществами, имеющими в определенной мере подобные физико-химические свойства.

ГЖХ-анализ парогазовой фазы широко используется для скрининга таких летучих соединений, как компоненты технических жидкостей, включая спирты, галогенорганических соединений и др. [8]. Детектором может служить универсальный детектор ионизации пламени (ДИП). Более селективное разделение достигается применением капиллярных колонок с полярными неподвижными фазами. Для повышения надежности определение можно проводить параллельно на двух колонках различной полярности. Чтобы обеспечить разделение веществ с различными физико-химическими параметрами, для улучшения разделения и хроматографического поведения анализируемых веществ и ускорения анализа используют программирование температуры колонки.

Попытка обобщить и создать схему анализа технических жидкостей с очень широким диапазоном температур кипения отражена в работе С.А. Савчука и соавт. [9]. Разработанная ими методика предназначена для обнаружения и количественного определения технических жидкостей (спирты, компоненты летучих растворителей, антифризы, моторное топливо) в крови, моче, слюне и других биологических объектах. Для обеспечения максимальной селективности и достоверности идентификации анализируемых веществ методика предполагает сочетание капиллярной ГЖХ с масс-селективным детектированием равновесной парогазовой фазы. Для идентификации компонентов используют программу фиксации времени удерживания (ФВУ), включающую библиотеку времени удерживания и масс-спектров около 100 определяемых соединений. Программа ФВУ позволяет регулировать параметры хроматографического анализа таким образом, что время удерживания исследуемых соединений остается неизменным при замене хроматографической колонки, а также при использовании этой методики на аналогичном оборудовании в другой лаборатории, что унифицирует процедуру анализа.

Ряд веществ при указанном варианте исследования имеют близкие параметры удерживания, и их раздельная идентификация возможна по масс-спектрам. Следует отметить, что данная система анализа разработана для конкретного импортного оборудования и не может быть реализована на большинстве приборов других фирм, в том числе отечественных производителей. Однако удачно выбранная хроматографическая колонка HP-FFAP, условия анализа, методы пробоподготовки, большой практический материал, наработанный авторами, позволяют рекомендовать данное пособие для использования в практике химико-токсикологических лабораторий.

Для определения фосфорорганических соединений (ФОС) в крови (плазма), моче, промывных водах, перитонеальной жидкости разработана скрининговая система ГЖХ-анализа с термоионным детектором [10]. Высокая селективность детектора к ФОС и малая его чувствительность к соединениям, содержащим азот, позволяют свести очистку экстрактов из биообъектов до минимума и/или полностью устранить эту трудоемкую операцию. Минимально детектируемое количество (в расчете по метафосу) составляет 0,01 мкг/мл. Анализ микроколичеств ФОС можно также проводить с помощью ГХ-МС и ВЭЖХ-МС. ФОС в промышленности производят в виде технических продуктов, поэтому при проведении ХТА желательно определять не только нативные соединения, но и их технологические примеси, а также метаболиты. Использование аппаратурных хроматографических методов успешно решает эту задачу.

Таким образом, за прошедшие 40 лет скрининговые методы не утратили свою актуальность и востребованность при ХТА и судебно-химическом анализе на этапе предварительного исследования. Современные потребности в методах экспресс-диагностики токсикологически значимых веществ диктуют необходимость разработки новых и усовершенствование существующих скрининговых методов в направлении повышения их чувствительности и специфичности.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

²e-mail: maniabel@gmail.com;
https://orcid.org/0000-0002-0861-5945;

³e-mail: a-l-e-x4@yandex.ru;
https://orcid.org/0000-0002-4855-4235