Использование методов иммуногистохимии (ИГХ) находит все большее применение в современной морфологии [1]. Не исключение и судебная медицина. Причины массивного некроза печени (МНП), его клинические и морфологические проявления, в частности при отравлении грибами, описаны давно [2—5]. Особенности повреждения паренхимы и реакции на него, характерные для различных причин МНП, до сих пор оставались вне внимания исследователей. Между тем их выявление может дать ключ не только к познанию патогенеза МНП, но и к пониманию функциональной морфологии печени в норме. В число функций этого органа входит обезвреживание неиммуногенных ксенобиотиков путем их метаболизма и выделения с желчью либо подготовки к выделению с мочой. Токсическое поражение печени возникает в случае, если происходит срыв ее детоксикационной функции.

В настоящее время исследователи слишком много внимания уделяют исследованиям на молекулярном и ультраструктурном уровнях, пренебрегая светооптическим исследованием. Между тем синтез обнаруженных ими фактов, переход от частностей к целостным теориям изучаемых явлений требуют изучения каждого явления на всех уровнях организации, и светооптические исследования еще далеко не исчерпали своих возможностей. Наблюдаемые при них феномены, являясь интегральными, могут играть эвристическую роль для поиска перспективных путей изучения тех же явлений на молекулярно-биологическом и субклеточном уровнях.

В современной литературе нет подробных данных об иммуногистохимическом или электронно-микроскопическом исследовании печени при отравлении бледной поганкой. По-видимому, это объясняется предпочтением исследователей экспериментального материала секционному и тем, что они не подозревают о возможности существенных различий МНП, вызванных различными этиологическими факторами, и используют для моделирования МНП более доступный тетрахлорметан.

Цель исследования — описание морфологических особенностей реакции печени человека на токсины бледной поганки на органном, тканевом и клеточном уровнях, а также установление темпа умирания при таких отравлениях.

Исследовали смертельное отравление бледной поганкой (Amаnita phalloides) 9 лиц мужского пола в возрасте от 2 до 44 лет и девочки 4 лет. Некоторые из пострадавших утверждали, что собирали маслята или сыроежки, другие не могли описать грибы; только один пострадавший указал морфологические признаки бледной поганки. Диагноз был установлен на основании клинической картины и не вызывал сомнений. Смерть наступила в стационаре на 5—7-е сутки после употребления грибов. Ведущим клиническим синдромом была печеночная недостаточность, непосредственной причиной смерти служила печеночная кома, которая в ряде случаев развивалась на фоне желудочно-кишечного кровотечения.

Две группы сравнения составили 10 наблюдений смертельного отравления хлорпроизводными углеводородов: дихлорэтаном — 8, сочетанием дихлорэтана и этиленгликоля — 1, тетрахлорметаном — 1 и 9 наблюдений вирусного гепатита В с фульминантным течением, завершившихся смертью.

Отравились хлорпроизводными углеводородов женщина 50 лет и 9 мужчин в возрасте от 23 до 66 лет. Трое приняли яд с целью суицида, 2 — в качестве суррогата алкоголя, 1 — случайно; в остальных случаях обстоятельства отравлений остались неизвестными. Смерть одного пострадавшего наступила на месте происшествия, остальных — в стационаре через 2—7 ч после приема яда; только 2 пострадавших прожили 2 сут с момента отравления, несмотря на интенсивную терапию. Печеночная недостаточность явилась причиной смерти только одного: пострадавший выпил тетрахлорметан. У остальных в плазме крови было повышено содержание билирубина и трансфераз, что указывало на поражение печени, но смерть была связана с токсическим действием дихлорэтана на головной мозг и/или сердце.

Фульминантный вирусный гепатит явился причиной смерти 5 мужчин и 4 женщин в возрасте от 21 года до 40 лет, не злоупотреблявших алкоголем. Их смерть наступила от печеночной комы в стационаре на 5—7-е сутки от начала болезни.

Трупы вскрывали и проводили гистологическое исследование. Кроме того, использовали гистоморфометрический метод (определение доли некротизированной паренхимы с помощью компьютерной системы анализа изображений) ИГХ с антителами к маркерам пролиферации (Ki-67) и апоптоза (bcl-1) фирмы «Dako» [1].

Макроскопически при отравлении бледной поганкой и тетрахлорметаном наблюдали классическую картину МНП: размеры и масса печени уменьшены (масса у взрослых 1300—1400 г), ткань дряблая, распластывается на столе, на разрезе пестрого вида, с чередованием участков темно-красного и охряно-желтого, почти оранжевого цвета. В одном случае имелись также серовато-зеленоватые поля. Обнаружили также признаки медленной смерти (белые свертки в полостях сердца), отека мозга и геморрагического синдрома. У большинства умерших от вирусного гепатита масса составляла от 2000 до 2500 г, отмечали увеличение лимфатических узлов воротной вены и селезенки.

Микроскопически при отравлениях бледной поганкой, помимо собственно МНП, обнаружили ряд особенностей.

1. Массивные поля некроза захватывали все гепатоциты, кроме перипортальных. В центрах долек — распад печеночных клеток, их лизис с явлениями коллапса стромы.

Ближе к портальным трактам гепатоциты еще сохраняли форму, хотя многие были лишены ядер и находились чаще всего в состоянии крупнокапельной жировой дистрофии. Признаков холестаза не наблюдалось (рис. 1). Некоторые гибнущие клетки давали положительную ИГХ-реакцию на bcl-2 (рис. 2). В почках пигментных цилиндров немного, они имели не характерный для желчных пигментов зеленоватый цвет, а золотисто-буроватый, указывающий на их гемоглобиновую или миоглобиновую природу.

В противоположность этому при фульминантном гепатите отмечали признаки холестаза в виде обесцвечивания кала (клинические и секционные данные), скоплений желчи в ткани печени и пигментных цилиндров с характерным зеленым оттенком в почках. При отравлении тетрахлорметаном все эти признаки также присутствовали, но, кроме того, произошло образование кристаллов оксалатов в канальцах почек, а желчные пигменты окрасили эти кристаллы в необычный зеленовато-коричневый цвет.

2. Среди погибающих и погибших, но еще нелизированных гепатоцитов встречаются клетки, жировая дистрофия в которых еще не достигла степени крупнокапельной (рис. 3). В их цитоплазме множество мелких округлых жировых капель с четкими границами, которые, даже заполнив всю клетку, не сливаются друг с другом, не оттесняют ядро на периферию, из-за чего клетка похожа на ягоду малины. Такая форма жировой дистрофии встречалась нам только при острых отравлениях гепатотропными ядами (токсины бледной поганки, галогенпроизводные углеводородов) и ни разу не наблюдалась при ином происхождении стеатоза печени.

При фульминантном вирусном гепатите преобладала баллонная дистрофия, тогда как жировая отсутствовала или имела характер очаговой средне- и мелкокапельной, причем в каждом гепатоците была лишь одна липидная вакуоля, оттесняющая ядро на периферию. Кроме того, наблюдали гиалиново-капельную дистрофию, внутриядерные включения и аномалии формы и размера гепатоцитов и их ядер. Таким образом, донекротические изменения печеночных клеток при различной этиологии МНП имеют совершенно разный характер.

3. При отравлениях бледной поганкой перипортально отмечалась пролиферация базофильных полиморфных гепатоцитов с крупными ядрами с диспергированным хроматином. Эти клетки образовывали примитивные трабекулы, реже тубулы (рис. 4). Высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение в клетках пролифератов и их гиперхромия свидетельствуют об их активном размножении. Эти же клетки давали положительную ИГХ-реакцию на маркер пролиферации Ki-67. Все это соответствует данным литературы [6], согласно которым камбиальные предшественники паренхиматозных элементов печени находятся вблизи портальных трактов. Пролиферация желчевыводящих протоков отсутствовала.

При фульминантном вирсном гепатите, хотя смерть пациентов наступала в те же сроки, признаки пролиферации полностью отсутствовали. В случае отравления тетрахлометаном их также не было, но это могло быть связано с быстрой смертью пострадавшего.

В зонах некроза, особенно по их периферии, отмечали активацию ретикулоэндотелия и лимфомакрофагальную инфильтрацию с примесью сегментоядерных нейтрофилов.

При фульминантном гепатите нейтрофилы обнаруживали в небольшом количестве только в одном наблюдении. В остальных случаях инфильтрат состоял исключительно из лимфоцитов и макрофагов, причем встречались погибшие гепатоциты, окруженные лимфоцитами, а также имеющие дефекты ткани, в которые внедрялись лимфоциты (признаки аутоиммунной реакции). В случаях токсической природы МНП подобные явления не встречались.

5. При отравлениях некроз всегда появлялся раньше и был выражен сильнее в центрах долек, при вирусном поражении нередко начинался перипортально или с мостовидного варианта, т. е. очаги некроза сначала соединяли портальные тракты друг с другом или с центральными венами и только потом распространялись на остальную паренхиму.

Маркеров иных заболеваний печени не обнаружили ни в одном наблюдении.

В других органах выявили признаки синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания, а в почках — умеренно выраженный некротический нефроз. Клинически им соответствовали снижение протромбинового индекса, содержания общего белка, фибриногена и количества тромбоцитов в крови, гипокоагуляция, повышение концентрации креатинина и мочевины и проявления геморрагического синдрома (тяжелые рецидивирующие желудочно-кишечные кровотечения, макрогематурия и др.). При фульминантном гепатите признаков диссеминированного внутрисосудистого свертывания не наблюдали, а в почках доминировал пигментный нефроз.

Таким образом, отсутствие желчных цилиндров в почечных канальцах при отравлениях бледной поганкой в некоторой степени может быть объяснено патоморфозом отравлений под влиянием современной детоксикационной и инфузионной терапии. В 50-е годы ХХ века больные умирали чаще всего через 2—3 дня после приема грибов [3], а в настоящее время летальный исход наступает на 5—7-е сутки, и продукты распада гепатоцитов успевают удалиться с мочой. Судя по различной степени повреждения и лизиса гепатоцитов, они гибнут не одновременно. Некроз печени при отравлениях бледной поганкой прогрессирует, и смерть от печеночной недостаточности наступает, если он охватывает примерно 90% паренхимы, т. е. когда сохраняются лишь камбиальные элементы и немногочисленные тяжело поврежденные зрелые гепатоциты. Если некроз развивается не одномоментно и продолжает прогрессировать почти до самой смерти, то в почках должно быть хотя бы немного желчных пигментов. Их полное отсутствие можно объяснить только ранним нарушением биосинтетических функций гепатоцитов, предшествующим их некрозу, т. е. влиянием токсинов бледной поганки на органеллы, в которых происходит биосинтез, — эндоплазматический ретикулум.

Этим же объясняется своеобразная форма жировой дистрофии, при которой мелкие капли липидов соприкасаются, но не сливаются. Такая ситуация возможна в случае, если они отграничены друг от друга мембраной, т. е. накопление жира вначале происходит в эндоплазматическом ретикулуме и только при его повреждении липиды выходят в цитоплазму.

В генезе холестаза, наблюдаемого при других вариантах МНП, важную роль играют частичное сохранение паренхиматозных элементов и функционирование некоторых поврежденных гепатоцитов. Отсутствие холестаза при отравлении бледной поганкой должно быть связано с полным прекращением функции гепатоцитов. Это означает, что сохранившие жизнеспособность малодифференцированные камбиальные элементы, образующие перипортальные регенераты, способны пролиферировать, но не могут выполнять биосинтетические функции [7]. Аналогично зрелые гепатоциты, пребывающие в состоянии дистрофии, но сохранившие жизнеспособность, также не способны их осуществлять, что приводит к смерти. Такую функциональную несостоятельность можно объяснить дефицитом энергии и пластических субстанций в условиях глубокой дистрофии и/или интенсивной пролиферации, а также специфическим действием токсинов бледной поганки на процессы биосинтеза.

Общеизвестно, что аманитины — наиболее токсичные вещества из этого гриба — блокируют синтез белка [4, 5]. Это должно вести и к прекращению синтеза небелковых соединений, поскольку осуществляющие его ферменты также являются белками. По мнению ряда исследователей, блокада РНК-полимераз — главный, но не единственный механизм действия токсинов бледной поганки. По-видимому, имеются и иные, пока неизученные механизмы, которые определяют селективную гепатотропность этих ядов и избирательное подавление специализированных функций печеночных клеток при относительном сохранении их способности к пролиферации и самоподдержанию.

В противоположность этому при вирусном гепатите наиболее тяжело поражаются перипортальные зоны, где находятся камбиальные элементы. По-видимому, именно с этим связано отсутствие признаков регенерации при фульминантном гепатите. Возможно, поражение камбиальных элементов играет роль и в развитии нарушений регенерации при выживании больных вирусным гепатитом типа В.

Существенные различия в морфологических изменениях гепатоцитов, предшествующих МНП различной этиологии, указывают на разные механизмы повреждений этих клеток при действии вирусных и токсических факторов.

Учитывая длительный период времени от употребления грибов до развития повреждения печени, можно предположить существование так называемого летального синтеза, т. е. ведущую патогенетическую роль не самих токсинов, а их метаболитов, которые также являются неизученными. Темп умирания в основной группе может быть оценен как замедленный с развитием печеночно-почечной недостаточности и ДВС-синдрома.

Исследование позволило выявить различия морфологических проявлений МНП при действии разных этиологических факторов — токсинов бледной поганки и вируса гепатита В; наметить перспективные направления научных исследований в области патофизиологии и патоморфологии печени. Необходимо изучение печени при МНП разного происхождения электронно-микроскопическими, химико-токсикологическими методами для определения последовательности изменений структуры органелл и нарушений различных биосинтетических процессов, а также выявления основных метаболитов аманитинов и их токсичности. Это позволит понять не только патогенез отравлений бледной поганкой, но и особенности детоксикационной функции печени и ее реакций на повреждение в различных условиях.

Полученные результаты могут быть использованы в судебно-медицинской практике для диагностики смертельных отравлений гепатотропными ядами, а также в клинической медицине для разработки патогенетической терапии при этих отравлениях. В частности, при невозможности пересадки печени наиболее перспективны активная детоксикация путем плазмафереза и гемодиализа вплоть до 5—7-х суток после употребления грибов, а также переливание плазмы для замещения белоксинтезирующей функции печени.

Показана роль апоптоза в гибели гепатоцитов при отравлении изученными грибными ядами.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.