Судебно-медицинская идентификация представителей семьи Демидовых

Интерес к истории России в наше время обретает новую силу. В этом плане имеют особое значение работы, посвященные материальной культуре древних погребений. Актуальность данной проблемы в последние годы возросла в связи с участившимися обращениями Церкви и органов следствия в судебно-медицинские экспертные учреждения для исследования захоронений, обнаруживаемых при восстановлении монастырей и храмов.

Научной базой для проведения соответствующих экспертиз в нашей стране являются фундаментальные труды проф. В.Н. Звягина и его школы [1-3], проф. П.Л. Иванова и его учеников [4-6]. Накоплен определенный опыт при проведении идентификационных экспертиз исторических деятелей и в Бюро судебно-медицинской экспертизы Ленинградской области [7, 8].

В настоящей работе представлены результаты последнего по времени такого комплексного экспертного исследования. В процессе работ в храме во имя Святого благоверного князя Александра Heвского в д. Александровка Гатчинского района обнаружены захоронения, которые, согласно сохранившимся метрическим книгам, относятся к представителям рода Демидовых. К настоящему моменту обнаружены четыре захоронения, два из которых принадлежат генерал-адъютанту П.Г. Демидову и его супруге Е.Н. Демидовой (Безобразовой), а два других предположительно - их сыну и дочери.

На первом этапе описано содержимое гробов, включая скелетированные останки, остатки одежды и обуви, различные сопутствующие предметы.

На этапе проведенного нами судебно-антропологического цикла работ был применен классический алгоритм последовательности и объема исследований с использованием стереомикроскопических, рентгенологических, остеометрических и математических методов.

Для идентификации путем установления возможных родственных связей между захороненными людьми проведено молекулярно-генетическое исследование останков. Следует подчеркнуть, что останки пролежали в склепах около 150 лет в условиях повышенной влажности и сезонных колебаний температуры. Эти факторы в совокупности привели к неудовлетворительному их состоянию. По рассматриваемой версии, в погребении №2 находился скелет мальчика 10-12 лет, что согласуется с проведенными ранее остеологическими исследованиями. Известно, что кости подростка менее устойчивы к деструкции, чем кости взрослого человека. Наряду с агрессивным воздействием внешней среды этот факт явился дополнительным препятствием при получении пригодных для анализа образцов ДНК. Ряд методических подходов в получении и анализе ДНК из исторических останков были разработаны при проведении идентификации членов царской семьи из захоронений под Екатеринбургом [4, 5]. Также был использован собственный 15-летний опыт работы со скелетированными останками.

Для получения препаратов ДНК выбрали наиболее сохранившиеся объекты в соответствии с данными литературы о количестве и пригодности для анализа ДНК, экстрагированной из различных костей скелета человека [9]. Из погребения №1 была взята рукоятка грудины - наиболее перспективная кость для генетического анализа, из остальных трех выбраны бедренные кости (рис. 1, 2, на цв. вклейке).

С целью генотипирования проб ДНК применяли автоматическую систему капиллярного электрофореза с использованием флюоресцентных красителей - модель ABI PRISM 310 GA («Applied Biosystems», США). Анализировали данные с помощью программного обеспечения GeneMapper Software V.3.2.1. Использовали набор реагентов AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США). В состав набора входят 15 локусов коротких тандемных повторов ДНК человека (STR) и сегмент гена амелогенина, расположенный на X- и Y-половых хромосомах. Входящие в состав набора системы анализа основаны на полиморфизме длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) [5]. С целью верификации генотипов использовался набор AmpFlSTR MiniFiler PCR Amplification Kit («Applied Biosystems, США). Особенностью набора является укороченная длина ампликонов - от 70 до 283 нуклеотидов, что важно для успешной амплификации деградированной ДНК.

Для анализа проб ДНК, полученных из образцов костной ткани мужчин, применяли набор реагентов AmpFlSTR Yfiler PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США). В состав набора 17 систем анализа тандемных повторов, расположенных на Y-хромосоме человека (Y-STR).

Амплификация проб ДНК проводилась на приборе 2720 Thermal Cycler («Applied Biosystems», США).

Для преодоления влияния ингибиторов ПЦР проводили очистку ДНК с помощью набора KR-011 (ООО «Омникс», Санкт-Петербург, РФ), представляющего собой колонки со вставкой силикатной матрицы.

При расчете вероятности родства использованы популяционные данные для населения Европы и России. Вычисленное значение соответствует Байесовой вероятности при 50% априорной вероятности родства.

Установление родственных связей в семейной группе является стандартной задачей судебной генетики. Однако получение и анализ геномной ДНК из древних костей делают эту задачу трудноразрешимой. На фоне крайне низкой концентрации очищенной из костей ДНК, решающее значение для успешного анализа образцов приобретает фактор ее деградации. В нашем случае только из останков погребения №1 с первой попытки была выделена пригодная для дальнейшего анализа ДНК. Из костных тканей других трех погребений циклы выделения геномной ДНК пришлось повторять несколько раз. Следует учесть, что каждый из таких циклов продолжается от нескольких дней до нескольких недель, причем все другие работы, связанные с исследованием ДНК из «современных» источников, были либо прекращены, либо дистанцированы от мест работы со «старыми» пробами [11-13]. Во время работы с историческими пробами были исключены все действия с образцами биологического материала, в том числе позитивными контролями амплификации. На каждом этапе получения препаратов и анализа ДНК ставилась соответствующая реакция без содержания исторической ДНК, представляя собой негативный контроль данной стадии протокола. Пробы ДНК из четырех погребений получали в разное время, не совмещая процессы ни на одном из этапов.

Количество ДНК в анализируемых образцах, полученных после проведения одного цикла, для погребения №1 составило 0,690 нг/мкл, после трех циклов для погребения №2 - 0,470 нг/мкл, двух циклов для погребения №3 и №4 - 0,056 и 0,285 нг/мкл соответственно. Таким образом, для останков из всех погребений удалось добиться необходимого для анализа количества геномной ДНК. Каждый препарат ДНК перед количественной оценкой с помощью ПЦР в реальном времени проходил дополнительную очистку от ингибиторов на колонках с силикатным матриксом [14]. Конечные препараты не содержали ингибиторов ПЦР.

Препараты ДНК подвергали анализу с применением мультиплексного набора Identifiler в соответствии с инструкцией. Только для пробы, экстрагированной из останков погребения №3, увеличили количество вводимой в реакцию ДНК-полимеразы без изменения числа циклов амплификации. Такого рода модификации стандартного протокола используют для исторических ДНК с целью получить положительный результат типирования и избежать дисбаланса по высоте пиков в гетерозиготах [15].

В результате анализа были получены 15-локусные профили ДНК, экстрагированной из каждого костного фрагмента четырех погребенных (см. таблицу).

Таким образом, установлено, что в погребениях №1 и №2 находятся останки мужчин, а в погребениях №3 и №4 - женщин. Генотипы мужчины из погребения №1 и женщины из погребения №3 в составе родительской пары комплементарно соответствуют генотипу мужчины из погребения №2 и одновременно не проявляют комплементарного соответствия генотипу женщины из погребения №4. Таким образом, не подтвердилась версия о принадлежности останков из погребения №4 - дочери Демидовых. Судя по генотипу женщины из погребения №4, ее прямая родственная связь как с П.Г. Демидовым, так и с Е.Н. Демидовой исключается.

С целью подтверждения родственных отношений между мужчинами из погребений №1 и №2 был проведен анализ Y-хромосомы, наследуемой строго по мужской линии от отца к сыну. Согласно законам наследования, гаплотипы отца и сына должны быть одинаковы.

На электрофореграммах с результатами анализа по 17 Y-STR-системам имеет место некоторая несбалансированность аллелей (рис. 3, на цв. вклейке).

Гаплотипы образцов костной ткани мужчин из погребений №1 и №2 совпадают по 17 Y-STR-локусам. Таким образом, подтверждается патрилинейное родство между анализируемыми мужчинами. Проведенная оценка статистической значимости указывает на то, что такое совпадение гаплотипов можно считать закономерным, т.е. обусловленным именно патрилинейным родством мужчин из погребений №1 и №2, с вероятностью не ниже 99,97%.

Оценка статистической значимости комплекса генетических данных, а именно блока из 15 аутосомных STR-локусов и 17 Y-STR-локусов, указывает на кровно-родственные отношения биологических родителей (мужчина из погребения №1 и женщина из погребения №3) и ребенка (мальчик из погребения №2), с вероятностью не ниже 99,999999998%.

Таким образом, суммируя полученные комплексные данные, можно заключить, что останки мальчика из погребения №2 с высокой долей вероятности принадлежат сыну родительской пары: П.Г. Демидова и Е.Н. Демидовой. Также доказано, что женщина, останки которой находились в погребении №4, не является дочерью П.Г. Демидова и Е.Н. Демидовой. В то же время обращает на себя внимание наличие «общих» аллелей по большинству (12 из 15 локусов) у женщины из погребения №4 и П.Г. Демидова. Это может служить указанием на наличие горизонтальных родственных связей между генотипируемыми людьми. Однако для доказательного подтверждения этой гипотезы целесообразно провести исследование гипервариабельных областей митохондриальной ДНК [14], в том числе у ныне живущих потомков рода Демидовых.