Введение

В стоматологии и челюстно-лицевой хирургии остро стоит проблема восстановления объема костной ткани в области дефектов, возникших в результате атрофии, травм, воспалительных и онкологических заболеваний [1]. Существующие ординарные остеопластические материалы теряют свою актуальность из-за внедрения материалов, активированных факторами роста остеоиндуктивного действия [2, 3]. Костный морфогенетический белок-2 (BMP-2) является одним из наиболее эффективных и изученных среди таких факторов. Обладая высоким остеогенным потенциалом, BMP-2 характеризуется коротким периодом полураспада, который составляет в среднем около 11 мин [4]. В связи с ограниченным периодом эффективности белка существует два подхода, с помощью которых возможно поддержание его действия. Один из них представляет собой использование высоких концентраций BMP-2. Например, в препарате Infuse Bone Graft («Medtronic», США) использована концентрация BMP-2 (1,5 мг/мл), которая на 6 порядков выше физиологической, что в ряде случаев приводит к формированию очагов эктопического остеогенеза, возникновению остеокластической резорбции кости [3]. Второй подход представляет собой создание матриц, характеризующихся пролонгированным высвобождением белка BMP-2. Ранее нами было проведено исследование по изучению кинетики высвобождения BMP-2 из различных биополимерных матриц. Исследования in vitro показали, что высокопористые (98%) гранулы полилактида, полученные методом сублимационной сушки из эмульсий, позволяют высвобождать BMP-2 в течение периода до 6 дней [5]. В то же время гранулы гидроксиапатита способны высвобождать белок в течение 15 сут, что предположительно может сделать процесс регенерации костной ткани более контролируемым и физиологичным [6].

Цель исследования: изучение биологических и остеогенных свойств гранул полилактида и гидроксиапатита, импрегнированных белком BMP-2, in vitro и in vivo.

Материал и методы

Полилактидные гранулы. Пористые полилактидные гранулы (PLA) были получены распылением и сублимационной сушкой эмульсий полимера Ingeo Biopolymer 4032D (Nature Works), растворенного в 1,4-диоксане. Пористость гранул достигала 98%, а диаметр составлял 1—2 мм. Для стерилизации применяли ионизирующее излучение с поглощенной дозой 15 кГр.

Гидроксиапатит. Пористые гранулы гидроксиапатита получали из губчатых частей плечевых и бедренных бычьих костей. Для этого кости пилили на пластины, промывали водным раствором детергента, затем размалывали в крошку. После этого крошку отмывали смесью органических растворителей и многократно обрабатывали раствором гипохлорита натрия (вариант ГА-1) либо этилендиамина (вариант ГА-2) в воде с кипячением и промежуточной промывкой водой для удаления органического компонента костной ткани и отмывали водой. Затем крошку прокаливали, отмывали PBS и сушили.

Рекомбинантный белок BMP-2. Этот белок BMP-2 был предоставлен лабораторией биологически активных наноструктур Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России. Белок получен в клетках Escherichia coli и очищен, как описано ранее [7], с удельной активностью 0,1 ед/мкг.

Для импрегнации гранулы материалов смачивали раствором белка, после чего проводили 5 циклов вакуумирования с последующим замораживанием и лиофилизацией.

Оценка остеогенных свойств полилактидных гранул, импрегнированных BMP-2 in vitro. В работе использовали культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани (ММСК ЖТ) крыс. Для культивирования клеток применяли ростовую среду ДМЕМ/F12 («Панэко», Россия), в которую были добавлены 10% эмбриональной телячьей сыворотки — ЭТС («PAA Laboratories», США), 0,584 мг/мл L-глутамина («Панэко», Россия), 5000 ед/мл пенициллина («Панэко», Россия), 5000 мкг/мл стрептомицина («Панэко», Россия). Инкубацию проводили при температуре 37 °C и 5% СО₂. Ростовую среду заменяли свежей каждые 2—3 сут.

Остеогенную дифференцировку оценивали при инкубации клеток в ростовой среде ДМЕМ, дополненной 10% ЭТС, 0,584 мг/мл L-глутамина, 0,05 мг/мл L-аскорбиновой кислоты («Sigma-Aldrich», США), 2,16 мг/мл β-глицерофосфата («Sigma-Aldrich», США) с PLA-гранулами, импрегнированными BMP-2 в концентрации 100 мкг/мл BMP-2, PLA-гранулами без белка и в контрольной группе без добавления материалов. Половину объема среды меняли каждые 3 сут.

Минерализацию внеклеточного матрикса выявляли с помощью окрашивания ализариновым красным. После завершения эксперимента клетки промывали изотоническим раствором хлорида натрия («Панэко», Россия) и фиксировали 70% этанолом в течение 30 мин при температуре 4 °C. Затем клетки окрашивали 2% водным раствором красителя («Sigma-Aldrich», США, pH 4,1) по инструкции производителя. Для микроскопии использовали микроскоп AxioObserver D1 с камерой AxioCam HRc («Carl Zeiss», Германия).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени проводили с использованием праймеров к генам Bmp2, Spp1, Bglap и интеркалирующего красителя SYBR Green I («Евроген», Россия). Для выделения РНК применяли набор RNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия), а синтез кДНК — набор RevertAid Kit («Thermo Scientific», Германия). Результаты нормировали по контрольным генам Gapdh и Actβ. Исследование проводили на амплификаторе Real-Time CFX96 Touch («Bio-Rad», США).

Для оценки продукции белков остеокальцина (Ocn) и остеопонтина (Opn), секретируемых ММСК ЖТ, клетки снимали с подложки с использованием смеси Версен-трипсин (1:1) («Панэко», Россия). Суспензию клеток центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 мин. После этого клетки лизировали с применением набора Protein Solubilization Buffer Kit («BioRad», США) согласно протоколу производителя. Иммуноферментный анализ проводили согласно инструкции производителя («Elisa kit», «Cloud-Clone Corp.», Китай) при длине волны 450 нм на приборе BioRad Reader xMark («Bio-Rad Laboratories», США).

Оценка остеогенных свойств полилактидных гранул и гидроксиапатита, импрегнированных BMP-2 in vivo. Для исследования in vivo использовали 30 самцов крыс линии Wistar массой тела 300—350 г. Животных содержали в виварии в стандартных условиях.

В зависимости от вида имплантируемого материала было сформировано 3 группы исследования: полилактидные гранулы, гидроксиапатит, обработанный гипохлоритом натрия (вариант ГА-1) либо этилендиамином (ГА-2). Гранулы материалов содержали BMP-2 в концентрации 100 мкг/мл.

Оценку остеоиндуктивных свойств материалов проводили на модели ортотопического остеогенеза. Для этого с помощью скальпеля формировали треугольный кожный лоскут в области теменных костей. С помощью алмазной фрезы формировали костный дефект диаметром 7 мм в области сагиттального шва. Материал укладывали в дефект. Рану послойно ушивали материалом Vicryl («Ethicon», США). Выведение животных из эксперимента осуществляли в CO₂-камере на 28-е сутки после операции.

Ткани из области имплантации брали с помощью ножниц и зуботехнического отрезного диска. Полученные некроптаты помещали в 10% нейтральный раствор формалина. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также по методу Массона (анилиновым синим) для визуализации тканевых структур. Анализ препаратов проводили с использованием светового микроскопа Axio Imager A1 («Carl Zeiss», Германия). После сканирования полученных изображений количественную морфометрию выполняли с применением программного обеспечения Adobe Photoshop 2023 («Adobe», США).

Эксперимент соответствовал рекомендациям локального биоэтического комитета и ГОСТ 31891-2012, ГОСТ 33215-2014, ГОСТ 33216-2014.

Статистический анализ. Статистический анализ полученных данных и построение графиков выполняли в программе GraphPad Prism v10.2 (США) и SigmaPlot v14.0 («Systat Software Inc.», США). Для определения нормальности распределения использовали тест Дагостино—Пирсона. Для межгруппового сравнения применяли критерий Краскела—Уоллиса с апостериорным тестом Данна в in vivo экспериментах и One Way ANOVA Holm-Sidak тест для in vitro исследований. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Оценка остеогенных свойств полилактидных гранул, импрегнированных BMP-2 in vitro. Инкубация клеток с полилактидными гранулами, содержащими BMP-2, приводила к остеогенной дифференцировки. На 14-е сутки в ММСК ЖТ, культивируемых в присутствии PLA с BMP-2, отмечалось увеличение экспрессии генов Bmp2, Spp1 и Bglap и продуцирования остеопонтина (Opn) и остеокальцина (Ocn) по сравнению с PLA-гранулами без белка и клетками в группе контроля (рис. 1, а, б). Инкубация клеток с импрегнированными BMP-2 PLA-гранулами также приводила к минерализации их внутриклеточного матрикса (рис. 1, в).

Рис. 1. Остеогенная дифференцировка MMCK ЖТ.

а — относительная экспрессия генов Bmp2, Spp1, Bglap, ПЦР-РВ. * — p<0,05 (vs. Control), ^# — p<0,05 (vs. PLA); б — продукция Opn, Ocn, ИФА. * — p<0,05 (vs. Control), ^# — p<0,05 (vs. PLA); в — окрашивание ализариновым красным, световая микроскопия, ув. ×4. MMCK ЖТ — мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани; ПЦР-РВ — полимеразная цепная реакция в реальном времени; PLA — пористые полилактидные гранулы; Ocn — остеокальцин; Opn — остеопонтин; ИФА — иммуноферментный анализ.

Внутрикостная имплантация. Анализ гистологических препаратов показал, что все материалы с BMP-2 оказывали остеоиндуктивное действие. Однако объем сформированной костной ткани и характер ее образования различались.

Так, при имплантации материала ГА-1—BMP-2 объем новообразованной костной ткани был незначительным. Костная ткань располагалась как на краях, так и в центре дефекта (рис. 2).

Рис. 2. Имплантация в область критического дефекта теменных костей материала ГА-1—BMP-2.

а, б — гистопанорама, окраска гематоксилином и эозином (а), по Массону (б); в, г — область дефекта, окраска гематоксилином и эозином (в), по Массону (г). ГА — гидроксиапатит; BMP-2 — рекомбинантный костный морфогенетический белок-2.

Имплантация ГА-2—BMP-2 приводила к формированию кости преимущественно по краям материала. Очаги костной ткани были сформированы вокруг гранул гидроксиапатита (рис. 3).

Рис. 3. Имплантация в область критического дефекта теменных костей материала ГА-2—BMP-2.

а, б — гистопанорама, окраска гематоксилином и эозином (а), по Массону (б); в, г — область дефекта, окраска гематоксилином и эозином (в), по Массону (г). ГА — гидроксиапатит; BMP-2 — рекомбинантный костный морфогенетический белок-2.

В группе, в которой был использован материал PLA—BMP-2, очаги неоостеогенеза обнаруживали во всем объеме костного дефекта. Костная ткань формировалась на периферии гранул и проникала в их центр (рис. 4). По данным морфометрии, относительный объем новообразованной костной ткани (Nb.Ar, %) при имплантации ГА-1—BMP-2 был статистически значимо меньше по сравнению с PLA—BMP-2: 7,3 [4; 10,3] и 18,5 [13; 24,7] % соответственно (см. рис. 4).

Рис. 4. Имплантация в область критического дефекта теменных костей материала PLA—BMP-2.

а, б — гистопанорама, окраска гематоксилином и эозином (а), по Массону (б); в, г — середина дефекта, окраска гематоксилином и эозином (в), по Массону (г). PLA — пористые полилактидные гранулы; BMP-2 — рекомбинантный костный морфогенетический белок-2.

Объем обрастающей материал соединительной ткани был статистически значимо больше в группах применения гидроксиапатита по сравнению с той, где использовали PLA, в то время как объем врастающей ткани был больше в группе PLA по сравнению с ГА-2—BMP-2 (рис. 5).

Рис. 5. Результаты морфометрии тканей, полученных при внутрикостной имплантации материалов ГА-1—BMP-2, ГА-2—BMP-2, PLA—BMP-2.

ГА — гидроксиапатит; BMP-2 — рекомбинантный костный морфогенетический белок-2; PLA — пористые полилактидные гранулы.

Проведенное исследование показало, что культивирование ММСК ЖТ с полилактидными гранулами, содержащими BMP-2, способствовало индукции остеогенной дифференцировки клеток. При этом остеоиндуктивные свойства исследуемых материалов были более выраженными по сравнению с данными других работ. Так, в исследовании с применением 3D-напечатанных PLA-матриксов с сорбированным на поверхности пептидом, содержащим последовательность BMP-2, ответственную за связывание с мембранными рецепторами и активацию сигнальных путей, показаны остеиндуктивные свойства материала [8], однако экспрессия ключевых маркеров остеокальцина и остеопонтина была ниже, чем в случае применения PLA гранул с BMP-2. В другом исследовании на клеточной культуре ММСК из костного мозга показано, что матриксы на основе PLA и полиэтиленгликоля с добавлением наногидроксиапатита, содержащие BMP-2, стимулировали остеогенную дифференцировку клеток [9]. Однако значительная экспрессия остеогенных маркеров наблюдалась и в контрольной группе с матриксами без белка, что указывает на существенный остеогенный потенциал самих материалов-носителей. В отличие от этих результатов, в настоящем исследовании наиболее выраженные признаки остеогенной дифференцировки продемонстрированы именно при инкубации клеток в присутствии полилактидных частиц, импрегнированных BMP-2.

При внутрикостной имплантации полилактидных гранул с BMP-2 наблюдалось формирование значительного объема костной ткани по сравнению с импрегнированными белком гранулами гидроксиапатита. Данный феномен, вероятно, объясняется комплексом факторов. В процессе биодеградации высокопористый полилактид способствует созданию пространства для миграции клеток и прорастания сосудов внутрь материала и обеспечивают высвобождение BMP-2, индуцирующего образование костной ткани как внутри, так и снаружи гранул [10]. В свою очередь гидроксиапатит за счет более длительного срока резорбции, а также способности удерживать белок на своей поверхности мог препятствовать формированию очагов остеогенеза [11].

Заключение

Полученные результаты демонстрируют выраженные остеогенные свойства BMP-2 в составе полилактидных гранул по сравнению с традиционно используемым в стоматологии гидроксиапатитом в качестве его носителя. Высокопористые полилактидные гранулы с рекомбинантным BMP-2 могут быть использованы для получения высокоэффективных костно-пластических материалов для восстановления костных дефектов.

Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России для ФГБНУ «МГНЦ».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.