Использование аутогенных трансплантатов для восполнения дефицита десны наиболее распространено в хирургической стоматологии в связи с более надежным прогнозом для сохранения объема и качества регенерата [1—3]. Однако этот метод связан с рядом требований и ограничений, таких как создание дополнительного операционного поля, что влечет за собой увеличение травматичности и послеоперационной болезненности. Еще одним недостатком является ограниченность донорских участков [4—6]. В связи с этим возникает необходимость в поиске заменителей аутотрансплантатов, среди которых наибольшее распространение приобрели материалы на основе коллагена [7, 8].

Однако большинство материалов на основе коллагена не способны дать стабильный прирост толщины мягких тканей десны из-за низкого уровня пористости и отсутствия стабильности объема [9]. Баланс между этими двумя параметрами, по заверениям производителя, был достигнут в материале Fibro-Gide (Geitstlich Pharma AG, Швейцария) [10]. Он представляет собой коллагеновый матрикс свиного происхождения, состоящий из волокон с поперечным сшиванием и имеющий пористую структуру [11]. В ряде исследований показано, что Fibro-Gide позволяет получить сопоставимый с аутогенной трансплантацией соединительной ткани результат, способствующий стабилизации кровяного сгустка и миграции клеток внутрь матрикса [12—15].

Клетки пульпы зубов могут мигрировать и участвовать в регенерации пародонта [16]. Однако пока нет достаточного количества лабораторных исследований материалов для регенерации пародонта и мягких тканей десны с использованием этих клеточных культур.

В последнее время в качестве модельной системы для тестирования цитосовместимости материалов получают распространение мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из пульпы молочных зубов (stem cells from human exfoliated deciduous teeth — SHED). Они имеют высокий пролиферативный потенциал и способны дифференцироваться в фибробластическом направлении и участвовать в регенерации соединительной ткани [17—18]. В последнее время на них исследуют имплантируемые и биорезорбируемые материалы для регенерации тканей. Однако еще не изучено, каким образом пористость и вид материалов, созданных на основе производных коллагена, влияют на клеточную адгезию и цитосовместимость.

Цель исследования — изучить поведение культуры клеток SHED на разных видах материалов для регенерации тканей пародонта с различной пористостью.

Материал и методы

Исследование проводили в лаборатории генетики стволовых клеток ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова».

Выделение и характеристика клеточной культуры. В качестве клеточной культуры для тестирования цитосовместимости носителей были использованы SHED человека. Выбор культуры обусловлен участием этих клеток в регенерации тканей не только пульпы, но и пародонта [14, 15].

Выделение SHED проводили из пульпы выпавших молочных зубов по ранее описанной технологии [16]. Культуру клеток SHED человека выделяли из пульпы, экстрагированной из выпавших молочных зубов детей 7—9 лет (n=4), после получения от родителей информированного добровольного согласия на использование биоматериала в научных исследованиях. Выпавший здоровый зуб без признаков воспаления помещали в стерильный флакон с транспортной средой F-12 («ПанЭко», Россия), содержащей 500 мкг/л амикацина («Синтез», Россия), 10 ед/мл гепарина натрия (Braun, Германия). Материал доставляли в лабораторию в термоконтейнере при температуре 2—8°C. Зуб обрабатывали 0,05% раствором хлоргексидина биглюконата («Росбио», Россия). При помощи стерильных пульпоэкстракторов («КМИЗ», Россия) из зуба извлекали пульпу и промывали ее раствором Хенкса с добавлением 0,5 г/л цефазолина («Синтез», Россия). Ткани пульпы измельчали стерильными ножницами и инкубировали в растворе коллагеназы I типа (2 мг/мл; «ПанЭко», Россия) 40 мин при температуре 37°C. Клеточную суспензию помещали в чашки Петри (Nunc, Дания) и культивировали в ростовой среде DMEM («ПанЭко», Россия), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку (Gibco, США), 2 mM L-глутамина («ПанЭко», Россия), 100 мг/л амикацина, при стандартных культуральных условиях (температура 37°C, 5% CO₂) до образования 70% монослоя. Ростовую среду меняли каждые третьи сутки.

Характеристику клеточных культур проводили в соответствии со стандартными требованиями [14]. Для этого клетки SHED на 3—4 пассажах в состоянии 70—80% конфлуентного монослоя снимали с культурального пластика раствором Версена с добавлением 0,25% трипсина («ПанЭко», Россия), фиксировали 4% параформальдегидом (Merck, Германия), промывали фосфатно-солевым буфером и инкубировали с моноклональными антителами к поверхностным маркерам, конъюгированными с флуорохромами FITC, TRITC, APC: CD29 (bd 559883), CD34 (bd 555824), CD44 (bd 555478), CD45(bd 555483), CD49b (bd 555498), CD73 (bd 550257), CD90 (bd555595) и HLA-DR (bd 559866) (BD Biosciences, США). Исследование выполняли на проточном цитофлуориметре-сортере BD FACSAria (Becton Dickinson, США).

Острая цитотоксичность и клеточная адгезия были исследованы in vitro на поверхности мембран и губок, производимых из коллагена с разной степенью плотности упаковки, конфигурацией поверхности и пористостью. Для этого были использованы пористый коллагеновый материал Fibro-Gide (Geitstlich Pharma AG, Швейцария), предназначенный для увеличения объема десны, и коллагеновая барьерная мембрана Bio-Gide (Geitstlich Pharma AG, Швейцария). Губка Spongostan (Johnson & Johnson Medical, Великобритания), изготовленная из денатурированного коллагена — желатина с максимально выраженными пористостью и смачиваемостью, была использована в качестве контрольного образца.

Определение острой цитотоксичности образцов. Для определения острой цитотоксичности использовали МТТ-тест — скрининговый метод оценки количества живых клеток в пробе. Тест основан на способности сукцинатдегидрогеназы митохондрий клеток восстанавливать светло-желтый МТТ (тетразолиум (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолиумбромид) с образованием темноокрашенных, не растворимых в воде кристаллов формазана.

Для проведения МТТ-теста клетки SHED на 3—4-м пассаже снимали с культурального пластика и высевали в лунки 12-луночного планшета в плотности 50 тыс. клеток на лунку. Спустя сутки, после полного распластывания клеток, в каждую лунку вносили экспериментальные образцы равного объема. Были использованы специальные вставки в лунки, которые обеспечивают свободную диффузию культуральной среды внутри лунки, но при этом исключают прямой контакт материала с клетками. Клетки инкубировали в лунках сутки при стандартных культуральных условиях (температура 37°C, 5% CO₂). Затем добавляли МТТ («ПанЭко», Россия) в концентрации 0,5 мг/мл. Кристаллы формазана экстрагировали из клеток с помощью диметилсульфоксида («ПанЭко», Россия), перемешивая на шейкере в течение 20 мин. Поглощение формазана оценивали, измеряя оптическую плотность элюата при длине волны 570 нм и вычитая фоновое значение при 620 нм на многофункциональном планшетном ридере EnSpire Multimode Plate Reader (PerkinElmer, США).

Статистический анализ полученных данных проводили в программе Prism v. 8.4 (GraphPad, США). Различия между группами выявляли с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорным тестом Холма—Шидака.

Оценка адгезии и миграции клеток. Для изучения прикрепления клеток к материалам и их миграции внутрь образцов на материалы высевали клетки SHED. Перед высеванием клетки окрашивали витальным флуоресцентным красителем PKH26 (Red Fluorescent Cell Linker Kit, Sigma, Германия) для дальнейшей визуализации.

В целях заселения материалов клетки, предварительно меченные красителем PKH26, центрифугировали и осадок разводили культуральной средой. Образцы материалов помещали в лунки 24-луночного планшета. Полученную клеточную суспензию с концентрацией 2 млн клеток в 1 мл наносили по 50 мкл на образец, после чего добавляли культуральную среду.

В 1-е, на 4-е и 8-е сутки из плашки извлекали по два образца каждого вида и исследовали расположение клеток на поверхности и внутри материала с помощью флуоресцентного инвертированного микроскопа AxioObserver D1 с камерой AxioCam HRc (Carl Zeiss, Германия).

Результаты и обсуждение

По данным МТТ-теста (рис. 1) было выявлено, что в присутствии коллагенового матрикса количество клеток в лунках не только не снижается по сравнению с контрольными группами (коллагеновой мембраны и коллагеновой губки), но даже несколько увеличивается, это может свидетельствовать о положительном влиянии исследуемого матрикса на пролиферативный потенциал клеточной культуры. Из всех исследуемых образцов только в присутствии коллагеновой губки наблюдалось уменьшение числа живых клеток в культуре.

Рис. 1. Результаты МТТ-теста.

По результатам оценки адгезии и миграции клеток обнаружено, что клетки прикрепляются ко всем исследуемым образцам материалов. При этом в коллагеновом матриксе и коллагеновой губке клетки выявляли как на поверхности, так и внутри материала уже в 1-е сутки. Плотность расположения клеток в исследуемом матриксе была выше, чем в коллагеновой губке. Клетки внутри этих материалов выявляли в течение всего эксперимента (8 сут), что видно на рис. 2.

Рис. 2. Адгезия клеток, окрашенных красителем PKH26, в 1-е сутки (а), на 4-е сутки (б) и на 8-е сутки (в).

На коллагеновой мембране в 1-е сутки клетки были выявлены только на поверхности материала, на 4-е сутки отмечали миграцию единичных клеток с поверхности мембраны в ее толщу, а на 8-е сутки наблюдали выраженную миграцию клеток внутрь мембраны, до половины ее толщины.

В одном из проведенных исследований по оценке параметров искусственных материалов отмечена важная роль пористости и способность искусственного материала достаточно долго поддерживать свою форму, что обеспечивает клеткам возможность проникать внутрь, а также обеспечивает диффузию питательных веществ и кислорода для поддержания жизни клеток [19]. Было показано, что достаточная пористость не только позволяет клеткам мигрировать внутрь материала, но также создает дополнительную площадь для адгезии клеток и пролиферации внутри материала.

В другом исследовании, с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками взрослого человека, была также отмечена важность упругости материала и его впитывающей способности (помимо пористости) [20]. Повышенная пористость материала существенно способствует адгезии, жизнеспособности и пролиферации клеток. Упругость материала создает корсет для клеток и способствует их пролиферативному росту. Высокая гидрофильность материала ускоряет проникновение биологических жидкостей внутрь материала. Таким образом, менее упругие материалы, такие как желатиновая губка, даже при достаточной пористости снижают адгезию и пролиферацию клеток, в то время как коллагеновые матриксы, напротив, повышают адгезивные и пролиферативные способности клеток.

В проведенном нами исследовании упругий коллагеновый матрикс Fibro-Gide показал лучшие результаты по сравнению с коллагеновой мембраной низкой пористости Bio-Gide и с желатиновой губкой Spongostan высокой пористости, но низкой упругости, что согласуется с описанными ранее исследованиями [20].

Кроме того, вероятно, что более низкие показатели адгезии и пролиферации губки Spongostan обусловлены желатином в составе губки. Это суждение косвенно подтверждает одно из исследований, в котором прикрепление и скорость роста клеток пульпы зуба человека (human dental pulp cells — HDPC) на матриксах из желатина были ниже, чем на матриксах из коллагена [21]. Так, активность щелочной фосфатазы у выращенных на коллагене клеточных культур была выше, чем у выращенных на желатине. Пик экспрессии мРНК остеокальцина из клеток, выращенных на коллагене, был обнаружен значительно раньше, чем у клеток, выращенных на желатине. Общая экспрессия мРНК дентинового протеина была снижена на желатине. Интенсивность минерализации внеклеточного матрикса также была выше у клеточных культур, выращенных на коллагене. Таким образом, коллаген поддерживает пролиферацию и дифференцировку HDPC лучше, чем желатин.

В исследовании in vitro коллагенового материала Mucograft, похожего на Fibro-Gide, было проведено его сравнение с мембраной Bio-Gide [22]. Результаты исследования подтверждют, что оба коллагена не токсичны и обладают схожим потенциалом адгезии и пролиферации для живых клеток. Однако в сравнительном исследовании материала Mucograft и коллагенового матрикса Fibro-Gide последний продемонстрировал бóльшую устойчивость к деградации в условиях in vitro [23]. Кроме того, в одном из метаанализов было показано, что материал Fibro-Gide позволяет сформировать больший объем десны, чем Mucograft, что авторы частично связывают с его лучшим воздействием на прогениторные клетки [24].

Заключение

Проведенное исследование in vitro показало, что наиболее благоприятным материалом для культуры клеток SHED является коллагеновый материал Fibro-Gide с достаточными пористостью, упругостью и гидрофильностью. Клетки SHED прикрепляются к коллагеновому матриксу и легко проникают в образец, заполняя все внутреннее пространство, при этом пролиферативная способность культуры клеток возрастает. Положительное влияние материала Fibro-Gide на прогениторные клетки соединительной ткани может объяснять его высокий клинический потенциал.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.