Оценка антисептических свойств комбинации хлоргексидина и биофлавоноида CITROX в отношении P. gingivalis (in vitro)

К причинам развития заболеваний пародонта относят множество факторов: уровень гигиены рта, генетическую предрасположенность, образ жизни, а также активность пародонтопатогенных бактерий. Именно они, по мнению большинства авторов, играют ведущую роль в патогенезе этого заболевания [1, 2].

К основным пародонтопатогенным микроорганизмам относят Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, и др. [3—6].

Очищение биопленки механически и с помощью вспомогательных антимикробных препаратов имеет первостепенное значение в профилактике заболеваний пародонта. К дополнительным средствам гигиены относят ополаскиватели рта и зубные пасты, содержащие антимикробные компоненты, такие как триклозан и хлоргексидин.

В настоящее время экологи выступают против использования триклозана, так как он наносит вред окружающей среде, и рекомендуют ограничить его использование. Установлено также, что у микроорганизмов развивается резистентность к триклозану [7—9].

Помимо триклозана наиболее часто используется хлоргексидин. Однако хлоргексидин, несмотря на то что является «золотым стандартом» среди антисептиков, вызывает ряд нежелательных эффектов: окрашивание зубов, реставраций, налета на поверхности зубов, а также может вызывать изменение вкусовых ощущений и имеет горький вкус [10—12]. Все перечисленные факторы приводят к тому, что пациенты неполностью соблюдают назначения врача и лечение проходит менее эффективно [13].

Ряд антисептиков, содержащих в своем составе спирт, также не рекомендуются для ежедневного использования. Спирт вызывает раздражение слизистых оболочек рта и, по мнению ряда авторов, может способствовать развитию онкологических заболеваний слизистой оболочки рта [14].

Таким образом, поиск оптимального антисептика для лечения и профилактики заболеваний рта остается актуальным. Для разработки новых лекарственных средств довольно часто используют растительные компоненты. [13, 15]. Предыдущие исследования показали эффективность природных антимикробных препаратов в отношении микрофлоры рта [16].

К природным антисептикам относятся флавоноиды. Термин «флавоноиды» появился в 1949 г., так как некоторые растения служили источником красителей желтого цвета (лат. flavus — желтый). В тот же период было выявлено их положительное влияние на кровеносные сосуды человека, заключающееся в способности уменьшать проницаемость стенок капилляров, что способствует заживлению ран [17—19].

К биофлавонидам, полученным из мякоти горьких апельсинов, относится запатентованный комплекс CITROX. Он водорастворим и обладает антимикробной активностью в отношении бактерий, грибов и вирусов. [15, 20, 21]. Биофлавоноид CITROX безопасен при употреблении внутрь и может применяться в качестве пищевой добавки в соответствии с Европейскими стандартами (EN), принятыми Европейским комитетом по стандартизации (CEN). CITROX используют в пищевой промышленности для увеличения срока годности мяса, рыбы и соусов [22, 23]. В стоматологии CITROX ранее не применялся.

В связи с указанными данными CITROX может представлять интерес в качестве ополаскивателя рта при заболеваниях пародонта. Существуют данные, подтверждающие, что CITROX и хлоргексидин потенцируют действие друг друга [21].

Цель исследования — оценка антисептических свойств комбинации хлоргексидина биглюконата в концентрациях 0,05 и 0,2% и биофлавоноида CITROX в отношении P. gingivalis.

В эксперименте были использованы клинические изоляты микробных культур P. gingivalis из коллекции кафедры микробиологии, иммунологии, вирусологии ФГБОУ ВО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова». Первичный посев исследуемого материала проводили на питательную среду Himedia Laboratories Pvt. Limited (Индия) на основе колумбийского агара с добавлением 5% дефибринированной бараньей крови и селективной добавкой для выделения неспоровых анаэробов. Поверочная идентификация чистоты культуры проводилась с помощью биохимических идентификационных тестов Biochem-Identification T-Kits (Himedia, Индия) и систем API (BioMérieux, Франция).

Базовой методикой для проведения эксперимента стала термостатирующая роторная система RTS-1 (Biosan, Латвия), осуществляющая современный тип перемешивания за счет формирования эффекта диффундирования вихревого типа. Трактовку результатов осуществляли по изменению оптической плотности — OD (показатель в единицах МакФарланда) при длине волны λ=850 нм.

Чувствительность выделенных штаммов определяли с использованием авторской методики серийных разведений, разработанной коллективом кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии ФГБОУ ВО «МГМСУ им. А.И. Евдокимова».

Для каждого варианта эксперимента была приготовлена микробная взвесь объемом 5 мл. Исходное оптическое значение этой взвеси составило 0,5 mcf (1,5·10⁸ КОЕ).

Для культивирования микробной культуры использовали центрифужные пробирки емкостью 50 мл с мембранным фильтром (Швейцария), в которые добавляли стерильный питательный бульон, микробную взвесь и комплекс биофлавоноидов CITROX.

Биокультивирование микробной популяции проводили в запараллеленной системе персональных биореакторов с использованием жидких питательных сред производства Himedia Laboratories Pvt. Limited (Индия).

Для подтверждения жизнеспособности культуры, а также для корреляции OD с количественной характеристикой культивируемой комбинации проводили высевы 1,0 мл взвеси на плотную питательную среду. Забор осуществляли в условиях ламинарного бокса в начале экспоненциальной фазы (период ускоренного развития клеток) и в окончании истинного экспоненциального прироста клеток с использованием автоматической пипетки и стерильных наконечников.

Для статистического анализа экспериментальных методик автоматического культивирования использовали метод построения регрессионной зависимости (парабола второго порядка) с оценкой критерия Фишера и коэффициентом корреляции Пирсона. При этом применяли метод наименьших квадратов, основанный на минимизации суммы квадратов отклонений некоторых функций от искомых переменных. Критерий Фишера (критерий рассеяния) применяли для проверки равенства дисперсий двух выборок. Различия расценивали как статистически значимые при p<0,05. При p<0,001 статистическая значимость считалась высокой.

По результатам культивирования клинического изолята P. gingivalis в контрольной пробирке лаг-фаза отмечалась до 6-го часа культивирования. Скорость метаболизма у данной культуры относительно невелика, поэтому отмечается явно выраженный период ускоренного развития клеток. Такой период развития на графике обозначен как P-1. Экспоненциальная фаза нахождения культуры отмечалась длительностью преобладания периода с 12 по 26 ч, с периодом диауксийного перехода в промежутке от 16 до 18 ч. Логарифмический пик (показатель АЛЬФА) был отмечен на 22-м часе эксперимента, с показателем оптической плотности 6,78±0,3 mcf. Период отрицательного ускорения отмечен непродолжительным временным отрезком. В эту фазу скорость размножения замедляется, а время генерации увеличивается. Наступление этой фазы обусловлено истощением питательной среды и накоплением в культуральной жидкости токсичных веществ, которые начинают ингибировать развитие культуры (рис. 1).

Рис. 1. Изменение оптической плотности в питательной среде P.gingivalis.

Достижение максимальной концентрации контрольного образца (показатель БЕТА) отмечено на 26-м часе культивирования (7,14±0,3 mcf). Фаза стационарного равновесия не отмечена изменением оптического числа, тем самым обусловливая отсутствие изменения равновесия среди отмирающих и вновь образующихся клеток. Средняя OD в данном промежутке составила 7,2±0,3 mcf (26—36-й час).

По результатам анализа кривых развития образцов с применением комбинации CITROX и хлоргексидина биглюконата в концентрации 0,2% отмечалась почти трехкратная задержка начала экспоненциальной фазы. Адаптивная фаза отмечалась до 16-го часа эксперимента с последующим линейным типом развития клеток. М-концентрация достигалась одновременно с таковой в контрольном образце, однако отмечено бактерицидное действие образца, которое выражено в сравнительно более низкой OD в ключевых фазах развития популяции. Средняя OD для данного образца — 1,11±0,3 mcf (26—34-й час).

Образец с применением только хлоргексидина в концентрации 0,2% также продемонстрировал существенную пролонгацию адаптивной фазы, которая превышала таковую у образца с добавлением комплекса биофлавоноидов. В данном варианте отмечено наличие первоначального периода клеточного развития (18—22-й час), который впоследствии перешел в незначительный по продолжительности и интенсивности лог-скачок. Экспоненциальная фаза отмечена до 26-го часа культивирования, что соответствовало предыдущему образцу. Средняя OD была статистически значимой относительно контроля (1,5±0,3 mcf), но существенно не отличалась от образца с добавлением комплекса CITROX. Фаза гибели микробной популяции была сравнительно одинаковой между данными образцами по тенденции развития и скорости спада кривой.

При культивировании образцов с концентрацией хлоргексидина биглюконата 0,05% аналогично предыдущим образцам отмечалась пролонгация лаг-периода до 8-го и 10-го часов (хлоргексидин 0,05% и хлоргексидин 0,05% + CITROX соответственно). Генеративная скорость в экспоненциальном периоде была ниже, чем у контрольного образца, а переход в отрицательное ускорение, наоборот, более быстрый. Для образца хлоргексидина 0,05% — в промежутке 20—22-й час с последующей средней OD в стационарной фазе 2,57±0,3 mcf (22—28-й час), а для образца CITROX + хлоргексидин 0,05% — в промежутке 24—30-й час с OD в стационарной фазе 2,69±0,3 mcf (24—28-й час). С учетом алгоритма разведения образцов при подготовке к культивированию данные пробы также задерживали рост изучаемого патогена, но с меньшей эффективностью, чем предыдущие образцы (рис. 2).

Рис. 2. Скорость бактериального прироста.

Комбинация комплекса биофлавоноидов CITROX и хлоргексидина биглюконата в концентрациях 0,05 и 0,2% активна в отношении пародонтопатогена P. gingivalis и может рассматриваться в качестве альтернативы хлоргексидину без добавок. Включение CITROX в ополаскиватель позволяет снизить концентрацию хлоргексидина в ополаскивателе, что может привести к снижению выраженности нежелательных эффектов и рассматриваться в качестве альтернативного средства при лечении заболеваний пародонта.

Финансирование. Работа выполнялась с использованием Уникальной научной установки «Трансгенбанк» при финансовой поддержке Российской Федерацией в лице Минобрнауки России в рамках проекта (Соглашение № 075-15-2021-668 от 29.07.2021 г.).

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.