Метод мультислойной сборки как альтернатива антибактериальным покрытиям медико-биологических имплантатов

Современный уровень развития медицинских технологий, в том числе и имплантологии, позволяет получать ожидаемые результаты. Срок функционирования имплантата зависит от многих факторов: наличия общесоматических заболеваний, вредных привычек, плотности костной ткани челюстей, адекватного ортопедического лечения и т.п., но основную роль играет выраженность эффекта остеоинтеграции [1, 8].

А. Jokstad считает, что определяющее значение для остеоинтеграции имеют микродизайн или особенности поверхности.

Т. Аlbreksson и соавт. выделяют такие свойства поверхности имплантата, как механические, топографические и физико-химические. В настоящее время исследователи в первую очередь обращают внимание на шероховатость поверхности, которая зависит от способа ее обработки и примененных технологий (введение активных веществ в покрытие, что должно способствовать возникновению химических и биологических связей [3, 4]. В изученной нами литературе, как отечественной, так и зарубежной, либо сравниваются типы поверхности имплантатов, либо описывается влияние поверхности имплантата на культуру клеток-остеобластов, либо приводятся данные гистологического анализа границы имплантат - кость.

Поиск оптимальной поверхности, гарантирующей остеоинтеграцию во всех клинических ситуациях, бесконечен, но тенденции направления этого поиска достаточно четко очерчены, о чем свидетельствуют данные экспериментальных исследований in vitro и in vivo как на животных, так и у человека [3, 5].

Несомненный интерес представляют работы о предупреждении микробной инвазии в периимплантатной зоне. На образцах с разной степенью шероховатости поверхности имплантата изучали влияние шероховатости на адгезию Pophyromonas gingivalis. Определено ингибирование адгезии микроорганизмов при шероховатости ниже 350 нм, соответствующей шероховатости абатмента. Титановую поверхность подвергали анодной оксидации в растворе NaCL, что придавало поверхности антибактериальные свойства благодаря тонкому перекисному слою, но это не изменяло остеокондуктивные свойства и поведение остеобластов [4-6].

Особые проблемы современной имплантологии - отторжение имплантатов и их заражение различными бактериями, а также инфицирование в ходе хирургического вмешательства. Требуются новые методы послеоперационного лечения и создание противомикробных имплантатов для предотвращения хирургических раневых инфекций. С постоянными имплантатами связаны высокая вероятность инфекций и сложность их лечения, поскольку требуются длительные курсы антибиотикотерапии и многократные хирургические вмешательства. Хирургический шовный материал также может рассматриваться как имплантат, и его бактериальное загрязнение повышает риск осложнений, особенно при протезировании и "загрязненных" операциях. Шовный материал, как и большинство имплантатов, имеет неотделяемую поверхность, к которой могут прикрепляться бактерии, образуя биопленки и тем самым осложняя ход лечения. Вышесказанное свидетельствует о необходимости проведения научно-исследовательских работ с целью получения новых средств целенаправленной доставки лекарственных веществ к очагу инфекции и разработки антибактериальных покрытий для имплантатов и шовного материала. В этом отношении могут быть полезны достижения современной медицины, биохимии и химии.

Ниже приводятся результаты использования для получения антибактериальных покрытий медико-биологических имплантатов метода мультислойной сборки биосовместимых полиэлектролитов и биоактивных агентов layer-by-layer (LbL) [2, 3].

Для получения антибактериальных покрытий использовали метод мультислойной сборки, подробно описанный в работах [4-6]. Хорошо очищенная твердая основа погружается в разбавленный раствор положительно заряженного полиэлектролита (хитозан) на время, оптимальное для адсорбции 1 монослоя (толщиной ≈1 нм), затем промывается и высушивается струей азота. Следующий шаг - погружение пластинки с положительно заряженным слоем в раствор отрицательно заряженного полиэлектролита (карбоксиметилцеллюлоза - КМЦ натрия) на время, необходимое для адсорбции монослоя. Пластинка снова промывается и сушится. Так получается 1 бислой "сэндвича". Мы наносили десятислойные покрытия из полиэлектролитов. Далее в полученную активную поверхность при определенных условиях внедряли биоактивные агенты с нужными характеристиками. В качестве твердой подложки использовали отработанные имплантаты, кремниевые пластинки, поверхность которых покрывали определенным количеством мультислоев из полиэлектролитов с антимикробными агентами.

Структура поверхностей была исследована методами сканирующей электронной (СЭМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ).

Основные энергетические характеристики антибактериального агента рассчитывали, исходя из условных квантово-химических исследований. Предварительную оптимизацию геометрии молекул проводили методом молекулярной механики ММ+. Для корректной оптимизации геометрии, изучения реакционной способности и основных физических свойств молекул был выбран метод РМ3, входящий в комплекс расчетных квантово-химических программ HyperChem версии 7 [7, 8]. Использовалось приближение Флэтчера-Ривса.

Микробиологические исследования проводились на музейных штаммах Еsoberichia Соli, грибов рода Candida и Staphylococcus с целью изучения антибактериальной активности пластин с содержанием активных компонентов - триклозана, нитрата серебра, йода, которые сравнивали с известным антисептическим препаратом Х (в состав которого входит йод) методом диффузии в агар.

Поверхность питательного агара засевали исследуемой культурой и накладывали пластины с содержанием активных компонентов: №1 - триклозан, №2 - нитрат серебра, №3 - йод.

В целях сравнительного анализа диски, пропитанные контрольным раствором Х, накладывали на поверхность культур. Чашки Петри с растворами штаммов помещали в термостат для инкубирования на 8-10 ч.

Результаты оценивали по величине зоны задержки роста микробов, используя 4-балльную шкалу (от 0 до 3).

В работе использованы образцы имплантатов из титана и кремниевые пластинки.

Все полиэлектролиты - poly (ethyleneimine) (BPEI; Mw 65 kDa, ПЭИ), хитазан, КМЦ натрия - произведены "Сигма" (Франция). Исходная концентрация ПЭИ - 0,3 осново-моль/л, КМЦ натрия - 0,06 моль/л, хитозана 0,06 моль/л, рН 8,5. Исходные концентрации водных растворов анитимикробных реагентов - 10^–3 моль/л.

Для получения мультислоев были использованы хитозан, несущий на себе положительно заряженные центры КМЦ натрия с отрицательно зараженными функциональными группами. В качестве антибактериальных агентов были выбраны триклозан, растворы ионов серебра и йода. После получения определенного количества бислоев на их поверхности и в слои были нанесены антибактериальные агенты. Схема получения мультислоев представлена на рис. 1

Полученные по описанной методике полислои были исследованы методом АСМ (рис. 2

Согласно полученным данным модифицированные поверхности мультислоев неоднородны, имеются значительные шероховатости, характеризующие наличие адсорбированных частиц. Для подтверждения этого образцы были дополнительно исследованы методом СЭМ (рис. 5

Результаты по СЭМ и АСМ идентичны и указывают на изменение природы поверхности полученных мультислоев после нанесения на них антибактериальных агентов.

Микробиологические исследования проводились с использованием мультислоев, содержащих активные компоненты - триклозан, нитрат серебра и йод - на музейных штамах методом диффузии в агар-агар.

Эти данные сравнивали с воздействием известного антисептического препарата, в состав которого входит йод по 4-балльной шкале (от 0 до 3). На рис. 6

Результаты антибактериальных исследований образцов, полученных методом мультислойной сборки, представлены в табл. 1

При изучении in vitro антибактериальной активности мультислоев, содержащих активные компоненты - триклозан, нитрат серебра, йод, было установлено, что наиболее выраженное, антимикробное действие оказывают мультислои, в состав которых входит триклозан. Мультислои, в состав которых входит нитрат серебра, оказывают умеренное антимикробное действие. Поверхность с нанесенными на нее ионами йода проявила антимикробную активность только в отношении E. coli, антимикробной активности в отношении других исследуемых микроорганизмов не выявлено.

Результаты исследований однозначно указывают на потенциальную антимикробную активность мультислоев, содержащих триклозан.

Триклозан относится к сильным антисептикам, обладающим высокой, эффективной антибактериальной активностью, сохраняющейся длительное время. Являясь антисептиком с широким спектром антибактериального действия, триклозан занимает 2-е место по антибактериальной эффективности после глюконата хлоргексидина. Химически он представляет собой 2,4,4"-трихлоро-2"-гидроксифенил эфир. В химической структуре триклозана, как и хлоргексидина, имеются атомы хлора, которые, вероятно, и обусловливают их антибактериальные свойства. Для уточнения активного центра взаимодействия атомов триклозана с функциональными группами поверхности мультислоев были проведены квантово-химические расчеты, результаты которых представлены ниже. Для корректной оптимизации геометрии молекул и изучения их реакционной способности и основных физических свойств был выбран метод РМ3, входящий в комплекс расчетных квантово-химических программ HyperChem версии 7 [7, 8], использовалось приближение Флэтчера-Ривса.

Геометрически оптимизированные молекулярные модели, на основании которых вычислены основные дескрипторы, представлены на рис. 7

В качестве дескрипторов реакционной способности исследованных молекул были взяты следующие электронные характеристики: общая энергия молекулярной системы (Etot), стандартные энтальпии образования (∆fH^o), энергии верхней занятой - молекулярной орбитали ВЗМО (EВЗМО) и нижней свободной МО (ЕНСМО), зарядовые характеристики (q) на гетероатомах и дипольный момент (μ) молекул в целом. Указанные параметры представлены в табл. 2

Анализ значений дескрипторов, представленных в табл. 2

Атомы хлора, вероятно, меньше задействованы в процессах образования межмолекулярных связей на поверхности мультислоев и поэтому обусловливают антибактериальную активность.

Важную роль в определении реакционной способности играют такие дескрипторы, как энергии граничных МО - ВЗМО и НСМО. Были рассчитаны энергии занятых и свободных МО и получено их графическое изображение (рис. 8

Анализ энергий граничных орбиталей ВЗМО и НСМО (ЕВЗМО - ЕНСМО) показывает, что разница в их энергиях составляет для триклозана 8,234 эВ. Это свидетельствует о том, что для систем с участием триклозана характерны орбитально-контролируемые процессы.

Отрицательный знак энергии НСМО в молекуле, несмотря на то что существуют нуклеофильные (электронодонорные) центры - атомы кислорода, в целом позволяет охарактеризовать как электрофильный реагент, для которого наиболее характерны процессы принятия "чужих" электронов на наинизшие вакантные (свободные) орбитали.

Таким образом, проведенные квантово-химические расчеты для молекулы триклозана показывают потенциальную химическую и биологическую активность этого соединения, а также прикладные перспективы этого препарата для модификации медико-биологических систем.

Адресное использование имплантатов на основе антибактериальных средств будет инновационным решением при составлении алгоритма лечения и наблюдения данной категории пациентов (хирургического, стоматологического профиля). Пациентам не надо будет назначать дополнительный курс лечения в виде антибиотикотерапии (для профилактики осложнений), противогрибковых и ряда других препаратов, что, несомненно, существенно повысит качество их жизни.