Широкое использование синтетических материалов в хирургии с целью укрепления тканей началось с середины XX века. Причем как в общей хирургии (для герниопластики), так и в таких более узких специальностях, как акушерство и гинекология [1, 2]. Критерии для «идеальных» синтетических пластических материалов были сформулированы еще в 1950 г. [3] и почти не изменились до сих пор. Указанные материалы не должны менять свои физические свойства под воздействием физиологических сред организма, должны быть химически инертны, не должны вызывать выраженную воспалительную реакцию при имплантации, не должны вызывать образования рубцов и т. д. В 1994 г. P. Amid и соавт. [3] добавили еще две важные характеристики: возможность прорастания собственными тканями и простота постановки имплантата.

Необходимо подчеркнуть, что современные сетчатые имплантаты (СИ), применяемые в гинекологических и хирургических реконструктивных операциях, обладают всеми заданными параметрами. Несмотря на это, наряду с ростом числа выполняемых операций увеличивается и количество так называемых имплантат-ассоциированных или «mesh-ассоциированных», осложнений (ИАО), например таких, как эрозии слизистой оболочки стенок влагалища [4, 5]. Средняя частота развития эрозий после такого рода операций в гинекологии составляет, по данным разных авторов [6, 7], 7,6—10,6%.

В связи с этим представляется важным в условиях эксперимента уточнить, с чем именно связаны возникающие осложнения. При этом надо иметь в виду, что существующие объективные сложности при постановке СИ в область тазового дна у экспериментальных животных в значительной степени ограничивают возможности по моделированию операции в эксперименте.

К ограничениям относятся невозможность использования мелких грызунов (мышей, крыс, морских свинок), технические сложности (малые размеры операционного поля, отсутствие специализированного хирургического инструментария при выполнении операций на средних экспериментальных животных (кролики, овцы, макаки). В связи с этим дизайн исследования приходится зачастую менять.

Для оценки биосовместимости СИ предложены различные экспериментальные способы [8]. В частности, в опытах на кроликах ранее было показано, что при установке в заднюю стенку влагалища имплантатов из полипропилена и свиного коллагена умеренная воспалительная реакция с минимальным фиброзом встречалась в обоих случаях [9]. Для изучения процесса спайкообразования синтетические СИ имплантировали в брюшную полость мышам [10]. Имплантат из полипропиленовой сетки индуцировал возникновение провоспалительной среды, однако воспалительная реакция носила краткосрочный (около 2 нед) характер и не провоцировала спайкообразования.

Весьма важными, отражающими биосовместимость материала, являются показатели системы фагоцитоза и уровни провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в тканях и экссудате из реципиентной зоны. Вполне понятно, что кумулировать (и впоследствии исследовать) влагалищный экссудат у лабораторных животных не представляется возможным. В связи с этим необходимы другие лабораторные системы.

Цель исследования — изучить в условиях эксперимента особенности тканевых реакций при введении в брюшную полость суспензии из синтетического сетчатого имплантата на основе полипропилена при минимальной хирургической травме.

Для введения в брюшную полость экспериментальным животным использовали следующую методику подготовки образцов. Фрагменты макропористой полипропиленовой сетки GyneMesh PS, используемой ранее в наборах Prolift, Prosima, а сейчас в наборах TVT, TVT-Obturator и др., измельчали, а затем в дистиллированной воде фиксировали на замороженный алюминиевый блок в криостате Leica CM 15105 при температуре –19 °С. После фиксации полипропиленовой сетки во льду делали многочисленные срезы препарата с толщиной среза 5 мкм. Затем образовавшуюся гетерогенную смесь собирали в чашку Петри и переносили в термостат, где выдерживали при температуре 27—31 °С в течение 6 ч. После испарения воды образовывался сухой остаток в виде «порошка» из измельченной полипропиленовой сетки, без примесей. В дальнейшем чашку Петри с измельченным образцом запечатывали в пакет для стерилизации и стерилизовали 58% гидроген-пероксидом с помощью стерилизатора Sterrad NX в обычном цикле при температуре 40 °C в течение 28 мин.

Исследование проводили на самках мышей-гибридов CBA×C57BL/6 (Питомник лабораторных животных «Рапполово»). Животные содержались в виварии ФГУП «Государственный НИИ особо чистых препаратов» ФМБА России при смешанном освещении, получали питьевую воду и гранулированный корм adlibitum. Измельченный порошок полипропиленовой сетки ресуспендировали в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида и вводили мышам опытной группы (30 мышей) внутрибрюшинно по 2 мл суспензии на животное шприцом с иглой 18G. Животные контрольной группы (30 мышей) получали инъекцию аналогичного объема изотонического раствора натрия хлорида.

Выбор места для введения исследуемого материала был основан на доказанном еще в 80-х годах XX века феномене, что биосовместимость имплантатов вне зависимости от их локализации контролируется в первую очередь макрофагальным компонентом тканевой реакции [11]. Более того, и для исследования in vitro взаимодействия клеток и биоматериалов выбор клеточного типа имеет решающее значение. Данные in vivo показывают, что во время заживления имплантата в тканях основным типом клеток, определяющим характер заживления, являются макрофаги [12].

Другое весьма важное преимущество заключается в том, что получить для исследования лаважную жидкость из брюшной полости относительно легко.

Для минимизации хирургической травмы была предложена инъекционная техника введения исследуемого материала в брюшную полость. Соответственно для этого было необходимо получить пробы полипропилена в виде суспензии, что было достигнуто с использованием специальной технологии (регистрационный номер патента 2015116545). Стерилизация полученной суспензии исключала вовлечение в воспалительную реакцию бактериального компонента. Измельченный и стерилизованный полипропиленовый имплантат сохранял свои физико-химические свойства, так как в процессе подготовки не подвергался действию высокой температуры, агрессивных абразивных или химически активных средств. Данные микроскопии подтверждали отсутствие поверхностных изменений на стерильных фрагментах измельченного имплантата.

Животных выводили из эксперимента через 20, 40 и 60 сут. После цервикальной дислокации животным промывали брюшную полость 5 мл холодной среды RPMI-1640 в течение 2 мин. Концентрацию клеток в лаважной жидкости подсчитывали в камере Горяева, отбирали необходимый объем для оценки фагоцитоза перитонеальных макрофагов. Остаток лаважной жидкости центрифугировали 10 мин при 200 g, отбирали осадок и замораживали при температуре –20 °С для последующего определения уровней цитокинов. После выполнения лаважа брюшную полость животных вскрывали и осматривали в целях оценки макроскопических изменений.

При оценке фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов в качестве объекта фагоцитоза использовали пекарские дрожжи, опсонизированные мышиной сывороткой. После взятия образцов перитонеальной лаважной жидкости и подсчета клеточности отбирали объем лаважной жидкости, содержащий 1 · 10⁶ клеток, доводили объем до 2 мл средой RPMI-1640 с 10% фетальной телячьей сывороткой (ООО «Биолот») и наслаивали полученную клеточную взвесь на чашки Петри диаметром 40 мм (Медполимер). Чашки инкубировали при температуре 37 °С в течение 1 ч для адгезии макрофагов к пластику. Затем среду из чашек удаляли, аккуратно отмывали неприлипшие клетки теплой средой, в чашки вносили 1,8 мл свежей среды с 10% сывороткой и 0,2 мл взвеси опсонизированных дрожжей. После этого чашки вновь инкубировали при температуре 37 °C в течение 1 ч и затем промывали от нефагоцитированных дрожжей изотоническим раствором натрия хлорида. Позднее изотонический раствор натрия хлорида удаляли, высушивали препараты в чашках на воздухе, фиксировали 96% этанолом и окрашивали по Романовскому—Гимзе.

Подсчет проводили при увеличении ×160 под иммерсией. Интенсивность фагоцитоза характеризовали с помощью фагоцитарного индекса (ФИ) — отношение числа фагоцитов, поглотивших частицы, к общему числу просмотренных фагоцитов, т. е. процента макрофагов, вступивших в фагоцитоз, и фагоцитарного числа (ФЧ) — среднего количества частиц дрожжей, фагоцитированных одним макрофагом [13]. Достоверность различий между группами оценивали с помощью непарного теста Стьюдента с неравными отклонениями. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

В полученных образцах перитонеальной лаважной жидкости экспериментальных животных определяли концентрации следующих цитокинов (интерлейкинов — ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-13, ИЛ-22 и интерферона-γ) с помощью коммерческих наборов Flow Cytomix производства «Bender MedSystems» в соответствии с инструкцией изготовителя на проточном цитофлюориметре EPICSXL («Beckman Coulter»). Анализ результатов (построение калибровочных кривых и расчет концентраций цитокинов в исследованных образцах) проводили с помощью программы Flow Cytomix Pro2.3 («Bender MedSystems»). После этого рассчитывали средние и стандартные отклонения концентраций исследованных цитокинов в контрольной и опытных группах животных. Достоверность отличий оценивали с помощью непарного t-теста Стьюдента с неравными отклонениями.

В ходе исследования фагоцитарной функции перитонеальных макрофагов мышей после введения измельченной полипропиленовой сетки установили следующее (см. таблицу).

При исследовании параметров цитокиновой реакции установили следующее. В отношении ИЛ-1 и ИЛ-5 ни в одном образце лаважной жидкости не было выявлено значений, превышающих чувствительность использованного метода (25 пг/мл). Повышенные уровни ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-22 и интерферона-γ были обнаружены в лаважной жидкости лишь у единичных животных. Минимальные концентрации ИЛ-10 (от 2 до 15 пг/мл) и ИЛ-13 (от 2 до 5 пг/мл) были определены в перитонеальной лаважной жидкости примерно у 50% животных, при этом достоверных различий между контрольной и опытной группами не выявлено.

Результаты исследования демонстрируют, что предложенная нами методика, заключающаяся в том, что замороженный в криостате фрагмент имплантата измельчают с помощью микротома до частиц размером менее 10 мкм, высушивают, стерилизуют, ресуспендируют в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида и вводят внутрибрюшинно мелким лабораторным животным с помощью шприца, после чего исследуют показатели функциональной активности различных биологически активных факторов, позволяет достоверно оценить реакции организма экспериментального животного на введение С.И. Вместе с тем возможность осуществлять забор образующегося экссудата на любом этапе послеоперационного периода может использоваться и для других целей и задач.

Предлагаемый способ реализует новый экспериментальный подход к оценке биосовместимости сетчатых СИ, обеспечивает минимальную хирургическую травматичность, возможность изучения клеточных и цитокиновых реакций местного иммунитета, позволяет использовать мелких лабораторных животных, что упрощает и удешевляет эксперимент, расширяет возможности исследователей.

В ходе эксперимента установлено, что при уменьшении хирургической травмы путем инъекционного введения суспензии измельченной полипропиленовой сетки GyneMesh PS, после завершения острой реакции организма на инородное тело (20-е сутки), продолжается умеренное местное иммунодепрессивное действие исследуемого инородного тела, проявляющееся в снижении фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов. В более поздние сроки (40-е и 60-е сутки) исследованные показатели у опытных животных не отличались от таковых в контрольной группе. По результатам эксперимента оформлен патент [14].

1. Установлено, что достаточно хорошая биосовместимость и инертность синтетического материала, используемого в наборах Prolift, Prosima, TVT, TVT-Obturator и др., позволяет минимизировать вероятность имплантат-ассоциированных осложнений.

2. Умеренное местное иммунодепрессивное действие синтетических имплантатов позволяет предположить, что различный уровень травматизации тканей при постановке сетки может в определенной степени моделировать реакцию, связанную с наличием инородного материала. Кроме того, выглядит обоснованным предположение, что степень выявленного местного иммунодепрессивного действия синтетических имплантатов может зависеть от особенностей состояния тканей на момент оперативного вмешательства.

Сведения об авторах

Паластин Петр Михайлович — ассистент кафедры акушерства, гинекологии и неонатологии ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова»; 197022, Россия, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6-8; тел. +7-9213980805; e-mail: palastin.petr@mail.ru;

Беженарь Виталий Федорович — доктор медицинских наук, профессор, руководитель кафедры акушерства, гинекологии и неонатологии ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова»; 197022, Россия, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6-8; e-mail: bez-vitaliy@yandex.ru;

Петров Александр Владимирович — кандидат биологических наук, заведующий лабораторией. ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» федерального медико-биологического агентства (ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России); 197110, Россия, Санкт-Петербург, Пудожская ул., д. 7; e-mail: secretary@hpb.spb.ru

*e-mail: bez-vitaly@yandex.ru