Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Ищенко А.И.

Лечебно-реабилитационный центр Росздрава

Сулина Я.Ю.

Кафедра акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России, Москва, Россия

Люндуп А.В.

НИИ молекулярной медицины, ЦКП «Регенеративная медицина» ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России, Москва, Россия.

Александров Л.С.

кафедра акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова

Ищенко А.А.

Кафедра акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета ГБОУ «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова», Москва, Россия

Горбенко О.Ю.

Лечебно-реабилитационный центр Росздрава

Создание тканеинженерной конструкции с применением мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для хирургического лечения пролапса гениталий

Авторы:

Ищенко А.И., Сулина Я.Ю., Люндуп А.В., Александров Л.С., Ищенко А.А., Горбенко О.Ю.

Подробнее об авторах

Журнал: Российский вестник акушера-гинеколога. 2017;17(1): 21‑26

Просмотров : 465

Загрузок: 7

Как цитировать:

Ищенко А.И., Сулина Я.Ю., Люндуп А.В., Александров Л.С., Ищенко А.А., Горбенко О.Ю. Создание тканеинженерной конструкции с применением мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для хирургического лечения пролапса гениталий. Российский вестник акушера-гинеколога. 2017;17(1):21‑26.
Ishchenko AI, Sulina YaYu, Lyundup AV, Aleksandrov LS, Ishchenko AA, Gorbenko OIu. Creation of a tissue-engineered construction using bone marrow mesenchymal stem cells for surgical treatment of genital prolapse. Russian Bulletin of Obstetrician-Gynecologist. 2017;17(1):21‑26. (In Russ.).
https://doi.org/10.17116/rosakush201717121-26

Пролапс гениталий (ПГ) — одна из наиболее актуальных проблем современной медицины. Нередко заболевание проявляется в репродуктивном возрасте и носит прогрессирующий характер. Частота пролапса гениталий, согласно данным мировой статистики, колеблется в широких пределах от 2—3% в экономически развитых странах до 85% в странах востока [1, 2]. Считается, что распространенность ПГ значительно увеличится в ближайшие десятилетия в связи с быстрым ростом численности населения в экономически развитых странах. Так, в США ежегодно около 200 000 женщин оперируются по поводу данной проблемы [3—5].

По данным В.И. Краснопольского и соавт. [6], Л.В. Адамян и соавт. [7], В.И. Кулакова и соавт. [8] опущение и выпадение внутренних половых органов наблюдаются у 15—30% женщин, а у женщин старше 50 лет частота ПГ возрастает до 40%.

Опущение и выпадение внутренних половых органов часто сопровождаются функциональными изменениями соседних органов, что придает особую значимость данной проблеме. Так, недержание мочи отмечается у 70,1% пациенток с ПГ, нарушение дефекации — у 36,5%, диспареуния — у 53,3% [9].

В настоящее время наиболее эффективным методом лечения ПГ является хирургическое вмешательство. Все методы хирургической коррекции ПГ можно разделить на три группы: первая — восстановление с использованием собственных тканей пациентки, вторая — с использованием биологических или синтетических материалов и третья — облитеративные методы, заключающиеся в полном закрытии просвета влагалища.

Пластика промежности с использованием собственных тканей сопровождается высокой частотой рецидивов — от 30%, что объясняется многими авторами изначальной потерей прочности соединительно-мышечного каркаса, а подобные операции восстанавливают его только на 50% [10, 11]. В связи с этим большое распространение получили операции с использованием нерассасывающихся синтетических материалов. Использование сетчатых протезов при пластике промежности сопровождается более низким процентом рецидивов (5—40%) по сравнению с другими методами оперативного лечения П.Г. Однако методики с использованием сетчатых имплантатов имеют недостатки в виде ряда послеоперационных осложнений (mesh-ассоциированные осложнения). Основными из них являются эрозия сетчатого протеза, инфекционные осложнения, mesh-ассоциированная ретракция, диспареуния, хроническая тазовая боль. В связи с этим возникает необходимость усовершенствования имплантационных материалов путем создания новой клеточно-инженерной конструкции для восстановления фасциальных дефектов тазового дна [12—14].

Материал и методы

Цель исследования — создание новой клеточно-инженерной конструкции для усовершенствования имплантационных материалов, применяемых при восстановлении фасциальных дефектов тазового дна. В задачи исследования входило:

— проведение сравнительного исследования взаимодействия аутогенного клеточного компонента (мезенхимальных стволовых клеток — МСК) с ранее отобранным полипропиленовым сетчатым имплантатом с оптимальными свойствами для адгезии, пролиферации на нем клеток, а также оценки возможности формирования сплошного клеточного покрытия, изолирующего материал;

— оценка их биосовместимости в экспериментальном исследовании на лабораторных животных (крысах).

Используемый сетчатый имплантат состоял из нерассасывающихся волокон, изготовленных из изотактического кристаллического стереоизомера полипропилена, синтетического линейного полиолефина (С3Н6)n, толщиной около 0,5 мм. Размер межнитевого пространства составлял 600×600 нм.

Клеточный материал — МСК был получен из костного мозга (КМ) у 6 здоровых взрослых лабораторных крыс линии Wistar (самцов). Животных предварительно маркировали путем нанесения насечек на ушах. Забор материала производился из коленного сустава. Для отделения мезенхимальных стволовых клеток от эритроцитов использовался лизирующий раствор (solution М, «Medonic»). МСК КМ животных были ферментативно диссоциированы с помощью добавления коллагеназы II типа («Gibco») до конечной концентрации 0,075% в течение 60 мин при температуре 37 °C. Затем коллагеназа инактивировалась с помощью равного объема полной питательной среды DMEM/F12 («Gibco»), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 ммоль/л L-глутамина, 100 ед/мл стрептомицина (Invitrogen). Полученную суспензию центрифугировали в 15 мл культуральной среды, производили посев первичной культуры клеток на культуральный флакон (25 см2, «Corning») инкубировали при температуре 37 °C в атмосфере, содержащей 5% СО2 с повышенной влажностью. Клетки пассировали с помощью 0,25% раствора трипсина/EDTA («Gibco»). Питательная среда заменялась 2 раза в неделю. МСК КМ второго пассажа забирались для участия в дальнейшем эксперименте. Оценка жизнеспособности проводилась при помощи трипанового синего красителя для исключения мертвых клеток под счетчиком TC-10 («Bio-Rad»).

Из сетки в стерильных условиях были вырезаны 12 фрагментов квадратной формы 10×10 мм (рис. 1). Сетки помещали в отдельные лунки планшета для культивирования. На каждый фрагмент сетки добавляли по 250 мкл клеточной суспезии (4·105 клеток), содержащей мезенхимальные стволовые клетки второго пассажа. Инкубировали при температуре 37 °C во влажной среде, содержащей 5% СО2 в течение 60 мин. Затем в каждую лунку добавляли по 2 мл культуральной среды, продолжая инкубацию в тех же условиях.

Рис. 1. Фрагментсетчатогоимплантатаразмером 10×10 мм.

Операция по имплантации хирургических сеток и клеточно-инженерных конструкций, полученных путем адгезии аутологичных мезенхимальных стволовых клеток (в течение 2 нед) на полипропиленовой сетке, была проведена в группе из 6 лабораторных животных. Под общим обезболиванием (Zoletil 100), строго по средней линии живота, отступя книзу от мечевидного отростка на 2 см, в продольном направлении, рассекались кожа и подкожная клетчатка на протяжении 3—4 см. Белая линия живота и передняя стенка влагалища прямых мышц (апоневроза) освобождались от клетчатки путем ее отсепаровки в стороны от срединного разреза на расстояние 1,5—2 см, формируя «карманы» (рис. 2).

Рис. 2. Кожа и подкожная жировая клетчатка отсепаровывались от апоневроза частично тупым, частично острым путем.

В двух сформированных таким образом «карманах» помещали две хирургические сетки 10×10 мм на равном расстоянии от белой линии живота: справа — нативная хирургическая сетка, слева — тканеинженерная конструкция, содержащая МСК КМ данного животного (рис. 3). При этом у одного подопытного животного была произведена имитация неправильной установки имплантата с последующей экструзией сетки путем помещения ее преимущественно в жировую клетчатку.

Рис. 3. Слева от средней линии установлена сетка с МСК КМ данной крысы, справа — контрольная сетка.

Осуществлялся тщательный гемостаз в ране, далее зашивалась кожа с подкожно-жировой клетчаткой. Дренирование раны не проводилось, кожный шов обрабатывался спиртовым раствором йодонада. После операции лабораторные крысы содержались в условиях вивария в просторных клетках с сетчатым дном на стандартном пищевом режиме. В послеоперационном периоде проводилось динамическое наблюдение за состоянием послеоперационных швов. Заживление послеоперационного шва наступало в среднем в течение 10—15 сут. Животные выводились из эксперимента через 2 мес (2 крысы) и 4,5 мес (4 крысы), образцы сеток отправлялись на гистологическое исследование. Образцы сеток вырезались, парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивались гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону, изучались в микроскопе Olympus BX51, фотографировались с помощью видеокамеры фирмы «Спецтехника» (Москва) и программы Launch CAM VIEW.

Результаты

МСК КМ легко размножались в пробирке и представляли собой однородную популяцию клеток веретеновидной формы после первого пассажа (см. рис. 4 и далее). Жизнеспособность клеток оценивалась путем подсчета в ТК-10>95%. На 3-и сутки отмечалась адгезия МСК на нитях сетки (преимущественно по углам) (рис. 5).

Рис. 4. СК КМ лабораторной крысы в виде монослоя в пробирке, первый пассаж. Ув. 40, фазовый контраст.

Рис. 5. Сетчатый имплантат с МСК крысы на 3-и сутки после нанесения. Стрелка указывает на адгезивную клетку. Ув. 100, фазовый контраст.

Через 14 сут после нанесения культур клеток на сетки отмечался рост колоний — часть ячеек закрывались клетками. Мелкие ячейки практически полностью были закрыты клетками (рис. 6). Образцы окрашивали акридиновым оранжевым и этидиумом бромидом. Стоковый раствор красителей готовили следующим образом: 1,5 мг акридинового оранжевого и 5,0 мг этидиума бромида растворяли в 0,1 мл 95% раствора этанола, затем добавляли 5 мл дистиллированной воды. Рабочий раствор красителей готовили из стокового путем растворения в 100-кратном объеме PBS. Для окрашивания предварительно отмытые от среды для культивирования образцы заливали рабочим раствором красителей на 5 мин. В результате происходило окрашивание акридиновым оранжевым живых клеток, а этидиумом бромидом — мертвых клеток (рис. 7). Локализацию флюоресцирующих образцов регистрировали с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии при помощи LSM-710. Через 1,5 мес были произведены забор и морфологическое исследование тканей, окружавших имплантированные сетки у 2 животных, у одного из которых была смоделирована запланированная экструзия.

Рис. 6. Сетчатый имплантат с МСК крысы на 14-е сутки после нанесения. Стрелка указывает на закрытие ячейки монослоем клеток. Ув. 40, фазовый контраст.

Рис. 7. Сетчатый имплантат с МСК крысы, 27-е сутки культивирования. Конфокальная микроскопия. Окраска: акридиновым оранжевым (зеленый цвет) — живые клетки (а), этидиумом бромидом (красный цвет) — мертвые клетки (б); в фокусе — одна плоскость.

Морфологическое исследование не выявило значимых различий при фиксации сеток к апоневрозу между нативной и тканеинженерной конструкциями (рис. 8). Однако при моделировании предполагаемого осложнения тканеинженерная конструкция вела себя более надежно: пропиленовая сетка, в отличие от опытного образца, проросла соединительной тканью, макрофаги и гигантские клетки были немногочисленными, что свидетельствовало о менее выраженной воспалительной реакции.

Рис. 8. Морфологическое исследование тканей, окружавших имплантированные сетки, через 1,5 мес. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200. а — контрольная группа; вокруг полипропиленовых волокон — макрофаги и гигантские клетки, а также сравнительно тонкая соединительнотканная микрокапсула вокруг каждой нити; вокруг всей сетки рыхлая соединительная и жировая ткань; б — опытная группа; пропиленовая сетка проросла соединительной тканью; макрофаги и гигантские клетки немногочисленны; воспалительная инфильтрация слабая.

У остальных 4 лабораторных животных забор материала производился через 4,5 мес после установки имплантатов (рис. 9). По вскрытии у одного животного имплантированный опытный материал не был обнаружен (вероятно, удален самим животным); у другого операция осложнилась экструзией сетки контрольного образца и выраженным воспалительным процессом.

Рис. 9. Результаты морфологического исследования тканей, окружавших имплантированные сетки, через 4,5 мес. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200. II. Опытная группа: в — уплотненная и рыхлая соединительная ткань вокруг сетки, слабая воспалительная реакция; г — нити сетки окружены тонкой капсулой, вокруг относительно рыхлая соединительная ткань, окружающая сетку, отмечается полнокровие и минимальная лимфомакрофагальная инфильтрация.

Результаты различались в зависимости от хирургических осложнений. При наличии экструзии сетки и расхождения швов имелась не только лимфомакрофагальная, но и достаточно выраженная нейтрофильная инфильтрация соединительной ткани, что, вероятно, было связано с инфицированием. В одном из наблюдений в контрольной группе инфицирование отсутствовало, и воспалительная инфильтрация образующейся соединительной ткани была минимальной. Однако соединительная ткань отличалась большей выраженностью отека и меньшей зрелостью. Через тот же срок в опытной группе воспалительные изменения были только в том случае, если происходила экструзия сетки и расхождение швов. В 2 случаях, в которых хирургических осложнений не было, соединительная ткань вокруг сетки отличалась зрелостью и минимальной воспалительной реакцией (в отличие от контрольной сетки у того же животного).

Обсуждение

Обычные имплантаты из инертных материалов могут устранить только физические и механические недостатки поврежденных тканей. Цель тканевой инженерии — восстановление биологических (метаболических) функций, т. е. регенерация ткани, а не простое замещение ее синтетическим материалом. Развитие клеточных технологий и вовлечение новых методов молекулярной биологии открывают возможности для восстановления значительных дефектов тканей и органов с использованием созданных in vitro искусственных тканей. Клеточный материал может быть представлен клетками регенерируемой ткани или стволовыми клетками. Стволовые клетки — недифференцированные клетки, способные делиться, самообновляться и дифференцироваться в один тип или более специализированных клеток. В гинекологии используется клеточный материал, полученный путем направленного дифференцирования стволовых клеток КМ, пуповинной крови или жировой ткани [15].

Первыми представили идею о клеточной терапии пролапса органов малого таза M. Но и соавт. [16], которым удалось простимулировать вагинальную репарацию у крыс. Они использовали стволовые клетки скелетных мышц мыши, культивированные in vitro и помещенные на поддержку, сделанную из бесклеточного подслизистого слоя тонкой кишки свиньи. M. Boennelycke и соавт. [17] использовали фрагменты свежих мышечных волокон, культивированных на синтетической биодеградантной поддержке с содержанием метоксиполиэтиленгликолполиактидгликоликовой кислоты, и имплантировали их в брюшную полость мышей. Спустя 8 нед возникала новая поперечнополосатая мышечная ткань и биосовместимый матрикс постепенно исчезал. Мышечные стволовые клетки (клетки-сателлиты), находящиеся в свежих изолированных мышечных волокнах, являлись катализаторами в процессе образования новой ткани [17].

Другая стратегия была предложена М. Hung и соавт. [18], которые использовали вагинальные фибробласты человека, культивированные in vitro и посаженные на синтетические биоразлагаемые PLGA-матриксы. Исследования in vivo не проводились [18].

СК легко выделить из КМ или жировой ткани и культивировать. Они широко используются в различных медицинских отраслях для восстановления и регенерации поврежденных тканей [19, 20]. МСК являются мультипотентными и могут дифференцироваться в различные виды ткани, например, в костную, хрящевую, жировую, ткани связок и сухожилий, и гладкомышечную ткань. Процесс дифференцировки направляется микроокружением в месте имплантации. Таким образом, аутологичные мезенхимальные клетки и, в частности, легко доступные стволовые клетки жировой ткани могут идеально подходить для лечения пролапса органов малого таза.

С. Dolce и соавт. [21] показали, что стволовые клетки КМ хорошо растут на PGA-сетках, и покрытие сеток клетками улучшает биосовместимость, снижая образование интраабдоминальных спаек у крыс. Интересные данные описала в своем исследовании группа австралийских хирургов [22], которые в качестве МСК использовали клетки эндометрия человека при хирургическом лечении ПГ при помощи полиамидных сетчатых имплантатов. В месте имплантации сетки с МСК эндометрия при гистологическом исследовании на 7-е сутки отмечалась значительная неоваскуляризация (р<0,05), а к 90-м суткам снижение количества макрофагов и инфильтрации лейкоцитов (р<0,05) [22, 23].

Коллективу китайских исследователей (M. Hung и соавт.) [24] удалось продемонстрировать улучшение регенеративной способности тканей при хирургическом лечении ПГ с использованием МСК из жировой ткани на сетчатом имплантате с коллагеновым гелем по сравнению с применением того же сетчатого имплантата без клеточного покрытия. Через 4 нед отмечалась активная экспрессия коллагена I типа и эластических волокон, а также произошли изменения в клеточной морфологии (изменилась конфигурация клеточного ядра).

Белорусскими хирургами (В.Г. Богдан, С.Г. Криворот, Т.Э. Владимирская, И.А. Швед, Ю.М. Гаин) [25] проведен анализ биосинтеза коллагена при различных вариантах пластики брюшной стенки с трансплантацией МСК, полученных из жировой ткани в условиях моделированной послеоперационной грыжи у лабораторных животных. В результате имплантация полипропиленовой хирургической сетки как изолированно, так и совместно с трансплантацией культуры МСК, полученных из жировой ткани, импрегнированной в желатиновый гель, при пластике брюшной стенки в области моделированного дефекта характеризовалась схожей динамикой изменения показателей экспрессии коллагена I и III типов, но различной степенью их выраженности. Получены данные в подтверждении влияния трансплантации МСК на улучшение структурных характеристик формирующейся соединительной ткани, с увеличением образования коллагена I и III типа, что в дальнейшем влияет на лучшую вживляемость в ткани полипропиленовой сетки.

Полученные зарубежными специалистами результаты свидетельствуют о перспективности изучения использования клеточно-инженерных конструкций в хирургии тазового дна. Мы не получили достоверных данных, свидетельствующих о значительном повышении биосовместимости сетчатых имплантатов за счет нанесения на них культуры аутологичных МСК. В эксперименте у 2/3 лабораторных животных в месте имплантации контрольного и опытного образцов сетки возникал воспалительный процесс или имплантат удалялся самим животным. Вероятно, нами неверно было выбрано место имплантации; она должна выполняться в анатомической области, недоступной животному (например, в области холки), что позволит повысить «асептичность» и, как следствие, результативность эксперимента.

Однако в двух наблюдениях, в которых отсутствовали инфекционно-воспалительные осложнения, соединительная ткань вокруг опытного имплантата отличалась зрелостью и значительно менее выраженной воспалительной реакцией в отличие от контрольного образца у одного и того же животного, что может свидетельствовать о ее лучшей биосовместимости.

Проведенная нами работа носит пилотный характер. Полученные предварительные данные позволяют сделать следующие выводы.

Возможно создание тканеинженерной конструкции на основе покрытия полипропиленового имплантата культурой мезенхимальных стволовых клеток. Необходимо продолжение данного исследования для получения статистически достоверных результатов о биосовместимости данной конструкции.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail