Опыт создания клеточно-инженерной конструкции для хирургического лечения тазового пролапса (предварительное сообщение)

Одной из важнейших проблем гинекологии является пролапс гениталий — патология, достигающая 34,1—56,3% среди женской популяции некоторых стран [1]. По данным отечественных авторов [2—4], частота пролапса гениталий колеблется от 1,7 до 38,9% и среди гинекологических заболеваний составляет 28—38,9%, около 15% от так называемых больших гинекологических операций. В структуре плановых показаний к оперативному лечению выпадение матки и влагалища занимает 3-е место после доброкачественных опухолей и эндометриоза [5, 6]. Особую актуальность проблема пролапса гениталий приобретает ввиду тенденции к «омоложению» этой патологии, сопровождаемой тяжелыми дисфункциональными изменениями соседних органов. У 85,5% больных развиваются функциональные расстройства смежных органов: недержание мочи — у 70,1% пациенток, нарушение дефекации — у 36,5%, диспареуния — у 53,3% больных [7].

Основным методом лечения является хирургическое вмешательство. По данным литературы, существует от 200 до 500 видов операций по устранению пролапса гениталий [5, 7]. Такое большое количество операций объясняется тем, что полученные результаты не всегда устраивают пациенток и врачей. Сохраняются определенная частота рецидивов и дисфункций мочевого пузыря, прямой кишки и нарушений сексуальной жизни, интра- и послеоперационные осложнения, побочные отрицательные эффекты. Так, частота рецидивов колеблется от 5 до 40%, а иногда достигает 50% [8].

Часто случающиеся рецидивы в реконструктивной тазовой хирургии привели к разработке методов лечения с использованием нерассасывающихся синтетических материалов (полипропилен и др.) для более надежного восстановления тканевых дефектов [9]. Однако использование таких материалов сопровождается возникновением негативных явлений — хронической воспалительной реакции у реципиента, потерей прочности, разрушением, асептическим отторжением имплантата [10]. В связи с этим возрос интерес к усовершенствованию имплантационных материалов путем создания новой клеточно-инженерной конструкции для восстановления фасциальных дефектов тазового дна [11—13].

Идеальный синтетический материал должен обладать свойствами, которые можно сформулировать как биосовместимость, инертность, отсутствие аллергических и воспалительных реакций, стерильность, отсутствие канцерогенности, экономическая доступность, легкость применения [9, 10, 14]. Кроме вышеуказанного, идеальная синтетическая сетка должна обладать легкой массой, макропорами, эластичностью, гибкостью. Она должна быть легко моделируемой, иметь неострые края и не вызывать значительную тканевую реакцию [14].

Цель исследования — создание новой клеточно-инженерной конструкции для усовершенствования имплантационных материалов, применяемых для восстановления фасциальных дефектов тазового дна у пациенток с различными видами пролапса гениталий.

Получение клеточного материала — дермальных фибробластов человека. Для получения клеточного материала был выбран здоровый доброволец, подписано информированное согласие и проведены клинико-лабораторные исследования с целью исключения воспалительных и инфекционных заболеваний. В условиях процедурного кабинета осуществлялся забор образцов кожи размером 2×3×1 мм. Образцы ткани помещали в транспортную среду с 3-кратным разведением антибиотиков (3% раствор пенициллина/стрептомицина, Invitrogen), доставляли в лабораторию, тщательно промывали в изотоническом забуференном фосфатом растворе (PBS). Дермальные фибробласты (ДФ) человека были ферментативно диссоциированы с помощью добавления коллагеназы II типа (Gibco) до конечной концентрации 0,075% в течение 60 мин при температуре 37 °C. Затем коллагеназа инактивировалась с помощью равного объема полной питательной среды DMEM/F12 (Gibco), содержащей 10% фетальную бычью сыворотку (FBS, HyClone) и 1% раствор пенициллина/стрептомицина (Invitrogen). Полученную суспензию центрифугировали в 15 мл культуральной среды, производили посев первичной культуры клеток на культуральный флакон (25 см^​2​᠎, Corning), инкубировали при температуре 37 °C в атмосфере, содержащей 5% СО2 с повышенной влажностью. Питательная среда заменялась каждые 48 ч. Клетки пассировали с помощью 0,25% раствора трипсина/EDTA (Gibco).

Характеристика клеток. Клетки, полученные из фрагмента кожи, обладали классической морфологией для дермальных фибробластов (см. рис. 1 и далее): адгезированные на пластике клетки веретеновидной формы, выстраивающиеся в направленные колонии [15].

В качестве матрикса использовались следующие сетчатые имплантаты:

— сетка PROLENE MESH, состоящая из нерассасывающихся волокон, изготовленных из изотактического кристаллического стереоизомера полипропилена, синтетического линейного полиолефина (С3Н6)n, имеющая толщину около 0,5 мм (рис. 2);

— сетка GYNEMESH, материал в которой идентичен по структуре нерассасывающемуся шовному материалу PROLENE (рис. 3). Голубые полипропиленовые волокна включены для создания контрастных полос на сетке; сетка состоит из уменьшенных в диаметре монофиламентных волокон, сплетенных уникальным образом, что делает ее приблизительно на 50% эластичнее, чем стандартная хирургическая сетка PROLENE.

Нанесение клеток на матрикс. Дермальные фибробласты человека третьего пассажа были нанесены на образцы сеток PROLENE MESH и GYNEMESH. Сетки в стерильных условиях разрезали на фрагменты размером 20×20 мм и помещали в отдельные лунки 6-луночного планшета для культивирования. 250 мкл клеточной суспензии (4×10^​5​᠎ клеток на образец сетки) по каплям равномерно распределяли на каждую сетку в отдельных лунках и инкубировали при температуре 37 °C во влажной среде, содержащей 5% СО2 в течение 30 мин для адгезии клеток на поверхности образцов. Далее 2 мл культуральной среды добавляли в каждую лунку планшетки для культивирования и продолжали инкубацию комплексов клеток с сетками в тех же условиях. Культуральную среду меняли каждые 48 ч.

Проводили световую и конфокальную^​*​ микроскопию образцов. Световую микроскопию осуществляли на микроскопе Nikon TE-2000 при увеличениях ×40, ×60, ×100, ×200, ×400 с фазовым контрастом. При конфокальной микроскопииобразцы окрашивали акридиновым оранжевым и этидиумом бромидом. В результате происходило окрашивание акридиновым оранжевым живых клеток, а этидиумом бромидом — мертвых клеток.

Локализацию флуоресценции образцов фиксировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM-710 («CarlZeiss Microscopy», Jena, Германия). Окрашенные образцы из чашек для культивирования in vitro переносились на стерильные чашки Петри с тонким стеклянным дном толщиной 0,16 мм в растворе PBS. Для получения изображений использовали объектив EC Plan-Neofluar 10x/0.3/М27. 3D-изображения получали путем реконструкции Z-стеков, получаемых при сканировании в режиме 1024×1024 пикселей (850×850 μм), при конфокальной диафрагме диаметром 34 μм, скорости сканирования 0,64 μс/пиксель.

В результате получали наложение флуоресцентных изображений локализаций акридинового оранжевого (зеленый цвет), этидиума бромида (красный цвет) и изображения, полученного в режиме проходящего света (при 3D-реконструкции режим проходящего света не включали в общее наложение).

Через 24 ч с помощью светового микроскопа удалось зафиксировать адгезию дермальных фибробластов (ДФ) с нитью полипропиленовой сетки GYNEMESH (рис. 4, 5).

На 33-и сутки после нанесения культуры клеток на сетки отмечался рост колоний, постепенное, почти полное закрытие пространств между волокнами в обеих сетках (рис. 6, 7).

Подтверждение первоначального обрастания поверхностей нитей дермальными фибробластами с дальнейшим заполнением ячеек сеток было выполнено с помощью конфокальной микроскопии. Начало закрытия ячеек клетками начиналось на 10—14-е сутки после посева клеток на сетку (рис. 8). Закрытие большей части ячеек многослойной клеточной структурой наблюдали к 30-м суткам (рис. 9), а закрытие всех ячеек наблюдали на 60-е сутки культивирования (рис. 10).

Проблема пролапса гениталий очень актуальна ввиду тенденции к «омоложению» этой патологии и отягощения ее дисфункциональными изменениями соседних органов у 85,5% больных. Основным методом лечения является хирургическая реконструкция анатомических нарушений тазового дна. Однако сохраняется высокая тенденция возникновения рецидивов и дисфункций мочевого пузыря, прямой кишки и нарушений сексуальной жизни, интра- и послеоперационных осложнений, побочных негативных эффектов.

В настоящее время зарубежные группы ученых предлагают использовать хирургические сетки, получаемые на основе природных биополимеров (из регенерированного фиброина шелка Bombyx mori, шелка паутинной нити, из белка 1F9 — аналога спидроина1 Nephila clavipes)[16—18]в силу того, что на них возможно образование монослоя из живых, способных к быстрой регенерации мезенхимальных стволовых клеток более быстрое, чем на синтетических хирургических сетках [19]. Однако к недостаткам биополимеров относят высокую стоимость их получения, сложность обработки, недостаточную механическую прочность. В качестве клеточного материала в зарубежной практике используются мезенхимальные стволовые клетки, а также фибробластоподобные клетки [20]. Получение данных культур клеток связано с большими техническими сложностями [21].

Мы использовали в данной работе наиболее широко применяемые в большинстве клиник хирургические сетки из полипропилена с растущими на них дермальными фибробластами человека, полученные наименее затратным и легким в проведении способом.

1. Современные клеточные технологии позволяют получить монослой дермальных фибробластов на поверхности современных сетчатых полипропиленовых имплантатов, используемых в хирургии тазового дна.

2. Данная клеточно-инженерная конструкция за счет усиления синтеза коллагена и прорастания фиброзной ткани на сетчатых протезах может привести к более прочному соединению сетки с окружающими тканями по сравнению с используемыми хирургическими имплантатами, не имеющими покрытия культурой дермальных фибробластов человека, что позволит использовать ее в лечении тазовых пролапсов у женщин, и, возможно, снизит частоту рецидивов.