Особенности клеточного и гуморального иммунитета у беременных группы риска развития инфекционно-воспалительных послеродовых заболеваний с оценкой структуры миометрия в пуэрперии

Инфекционные осложнения послеродового периода - одна из наиболее серьезных проблем современного акушерства. Анализ причин материнской смертности в России на протяжении последних 10-15 лет показывает, что сепсис и септические послеродовые осложнения остаются в числе трех наиболее частых причин материнской смертности в РФ и составляют 3,8% [8-10]. Послеродовой эндометрит (ПЭ) является наиболее распространенной формой послеродовых осложнений и вместе с тем одной из основных причин развития генерализованных форм инфекции [3, 10]. Частота развития ПЭ составляет 2-10% в общей популяции родильниц, а в группах высокого риска развития инфекционно-воспалительных послеродовых заболеваний достигает 80,4%, при сочетании нескольких факторов - 91% [4, 5]. По данным Американской академии педиатрии и Американского колледжа акушеров и гинекологов (ACOG), эндометрит развивается примерно у 60% женщин после кесарева сечения (КС), проведенного по медицинским показаниям, и у 24% после элективного КС [11, 12]. В большинстве случаев инфицирование полости матки в родах и послеродовом периоде происходит восходящим путем [13, 14].

Однако к основным факторам риска развития инфекционных осложнений после родов относятся следующие состояния: воспалительные заболевания наружных и внутренних половых органов (вульвит, кольпит, бактериальный вагиноз, цервицит, перенесенный ранее эндометрит, аднексит, тромбофлебит вен таза и т.д.); воспалительные процессы мочевыделительной системы; хронические и острые инфекционные заболевания во время беременности и родов. Таким образом, формирование воспалительных заболеваний в послеродовом периоде происходит до беременности и во время нее, а реализуется в послеродовом периоде. Нормальное течение послеродового периода во многом определяется процессами обратного развития матки, а также регенерацией ее раневой поверх­ности. Замедление процессов инволюции матки, особенно в 1-ю неделю послеродового периода, создает угрозу развития септических осложнений. При недостаточной ретракции матки облегчается доступ микроорганизмов в ее полость из влагалища и возможность развития ПЭ. Соответственно, факторы риска создают определенные условия, так называемый преморбидный фон, который становится основой реализации последующих воспалительных процессов.

Цель исследования - изучение особенностей иммунного статуса у беременных группы высокого риска развития инфекционно-воспалительных послеродовых заболеваний с последующим исследованием структуры миометрия в послеродовом периоде.

Обследованы 347 пациенток. Основную группу составили 317 беременных и родильниц с высоким риском развития инфекционно-воспалительных послеродовых заболеваний, контрольную - 30 практически здоровых беременных и родильниц.

Критериями включения в основную группу послужили добровольное информированное согласие пациенток, изменение объема околоплодных вод во время данной беременности (хроническое и острое многоводие, маловодие), обострение генитальных и экстрагенитальных заболеваний инфекционной природы во время данной беременности, проявления внутриутробной инфекции у новорожденных. Критериями исключения из данной группы являлись физиологическое течение беременности у здоровых беременных, активное течение специфических инфекционных (туберкулез, вирусные гепатиты B, C) и венерических (сифилис, гонорея, хламидиоз) заболеваний у беременных, наличие криминального вмешательства с целью преждевременного прерывания беременности. В контрольную группу включались здоровые родильницы с благоприятным акушерским и соматическим анамнезом, неосложненным течением настоящей беременности и родов.

Определение субпопуляционного состава лимфоцитов (n=53) проводилось на проточном цитофлюориметре Cytomics FC 500 с пробоподготовкой образцов на станции TQ-Prep. Изучение состояния цитокиновой системы (n=53) выполнялось методом иммуноферментного анализа, в сыворотке крови определялось содержание фактора некроза опухоли (ФНО) и интерлейкинов (ИЛ).

Проводилось морфологическое исследование участков плацент (n=90) у родильниц основной группы. Во время планового абдоминального родоразрешения проводилась биопсия участка миометрия (n=9) в нижнем сегменте матки для проведения морфологического и иммуногистохимического исследования. Забор биоптатов осуществлялся до извлечения плода у 6 пациенток основной группы и 3 - контрольной группы. Дополнительными критериями исключения из данного исследования явились наличие рубца на матке после перенесенного КС, наличие признаков острого воспалительного процесса любой локализации. Окрашивание препаратов проводилось гематоксилином и эозином по стандартной методике. В ходе иммуногистохимического анализа проводили верификацию и изучение распределения в миометрии белков CD3+ (Т-лимфоциты), CD20+ (B-лимфоциты), CD68 (макрофаги) и актина. Использовались моноклональные антитела к макрофагам CD68, CD3+, CD20+; набор моноклональных антител к гладкомышечному актину (Actin, Skeletal Muscle Ab-2. Clone: '5C5.F8.C7; alpha-Sr-1). Морфометрический анализ иммуногистохимических препаратов проводили с помощью программы ImageJ 1.46. На 8-битовых изображениях выделяли пороги гистограммы, соответствующие маркированным клеткам. Обработка данных осуществлялась с помощью пакета прикладных программ Statistiсa 6.1 и стандартных математических таблиц Microsoft Excel.

Группы были сопоставимы по возрасту: возраст пациенток основной группы составил 27,8±0,3 года, контрольной группы - 27,9±1,1 года (р=0,878923). При изучении возрастного состава установлено преобладающее число пациенток (30,3%) в возрасте от 25 до 29 лет, в возрасте от 19 до 24 лет - 25,9% женщин и 26,8% пациенток имели возраст 30-34 года. Анализ характера репродуктивной функции в анамнезе показал, что пациентки обследуемых групп значительно (р=0,026476) различались по паритету беременности и родов: в среднем на одну пациентку основной группы приходилось 2,7 беременности, а на одну пациентку контрольной группы - 0,9. В основной группе 45,5% женщин имели более трех беременностей в анамнезе, 40,1% - одну или две, 14,4% были первобеременными. В контрольной группе у 41,7% пациенток была первая беременность, у 52,1% - повторная и только 6,3% женщин имели три беременности в анамнезе. В основной группе у 63,6% женщин имело место искусственное прерывание беременности методом медицинского аборта, у 32,7% - однократно, у 30,9% - 2 раза и более. При анализе частоты невынашивания беременности выявлены достоверные (р=0,002321) различия между основной и контрольной группами. У 30,7% женщин основной группы были в анамнезе самопроизвольные выкидыши.

Проведенный анализ гинекологических заболеваний у родильниц основной группы показал, что наиболее часто встречались воспалительные заболевания органов малого таза (47,6%), нарушения микробиоценоза влагалища регистрировались в 36,9% случаев, цервициты - в 34,7%, перенесенные оперативные вмешательства на маточных трубах - в 8,5%, бесплодие - в 5,7%, нарушения менструального цикла - в 3,5%.

Среди экстрагенитальных заболеваний преобладали анемии - 60,3% случаев, на втором по частоте месте - вегетососудистые расстройства - 31,6%, хронические воспалительные заболевания мочевыделительной системы регистрировались у 27,1% женщин, хронические воспалительные заболевания органов дыхания - у 18,6%, ожирение - у 18%, артериальная гипертензия - у 11,9%, варикозная болезнь вен нижних конечностей - у 6,3%, сахарный диабет - у 2,2%.

Наиболее частыми осложнениями настоящей беременности у обследуемых пациенток были воспалительные изменения во влагалище (вагиниты - 53,6%), которые коррелировали с рецидивирующей угрозой прерывания беременности (49,8%) (rc=0,72; р<0,01) и преждевременным разрывом плодных оболочек (47,3%). Острые респираторные заболевания перенесли во время настоящей беременности 20,5% женщин, обострение хронических воспалительных заболеваний мочевыделительной системы отмечено у 18,9% беременных. Преэклампсия разной степени тяжести встречалась у 39,1% пациенток, в том числе в сочетании с задержкой роста плода - у 26,5%.

При проведении сонографического мониторинга во время беременности у пациенток основной группы с высоким риском развития послеродовых инфекционно-воспалительных заболеваний были выявлены маркеры внутриутробного инфицирования, среди которых маловодие диагностировалось в 42,9% случаев, нарушение плодово-плацентарного кровотока - в 39,5%, многоводие - в 17,9%; утолщение плаценты, превышающее соответствующие нормативы для данного срока беременности, выявлялось в 15,5%; пиелоэктазия у плода - в 9,5%; гиперэхогенный кишечник у плода - в 9,5%; гидроцефалия - в 1,7%; наличие кальцинатов в печени плода выявлено в 1,7%.

Пациентки основной группы были родоразрешены абдоминальным путем в 45,4% случаев, контрольной - в 63,3%, при этом КС было повторным в контрольной группе у 23,3% женщин, в основной группе - у 16,1%. В большинстве случаев КС проводилось в плановом порядке (56,6 и 78,9% соответственно). Основными показаниями к производству КС явились сочетанные экстрагенитальные заболевания, преэклампсия тяжелой степени, рубец на матке после кесарева сечения. В основной группе в 30,6% случаев КС осложнилось гипотонией матки и кровотечением, поэтому с целью остановки кровотечения в 22,2% проведена операция перевязки маточных артерий. Количество родоразрешенных через естественные родовые пути в основной группе составило (n=173) 54,6%, в контрольной группе (n=11) - 36,7%. Безводный промежуток в основной группе составил 24,84±51,26 ч, в контрольной группе - 4,08±3,17 ч (р=0,004561). У пациенток основной группы длительность безводного промежутка при родоразрешении через естественные родовые пути составила 30,29±5,12 ч, при оперативном - 4,18±1,18 ч (р=0,001).

У наблюдаемых пациенток обеих групп в III триметре беременности проведено определение субпопуляционного состава лимфоцитов и исследование цитокиновой системы (n=53), в основной группе - у 35 пациенток, в контрольной группе - у 18.

Результаты проведенного иммунологического исследования беременных представлены в таблице.

В данной группе показатели провоспалительных цитокинов (IL-1β, ФНО) были выше (р<0,05), чем в контрольной группе, а уровни цитокинов ИЛ-6, ИЛ-8 имели тенденцию к повышению, что свидетельствовало о системной активации фагоцитоза. Превышение определенного порогового значения данных факторов во время беременности является одним из механизмов, запускающих развитие патологических реакций, приводящих к срыву адаптации, способствующих развитию таких осложнений, как преждевременное прерывание беременности, антенатальная гибель плода [1, 2, 6, 7].

Учитывая наличие нарушений в системном иммунитете у беременных основной группы, мы предположили возможность возникновения изменений в структуре миометрия у этих пациенток. С этой целью проведено исследование биоптатов миометрия, взятых во время КС из нижнего сегмента матки, у пациенток основной (n=6) и контрольной (n=3) групп.

Изучение биоптатов миометрия, окрашенных гематоксилином и эозином, показало, что в основной группе (n=6) часто встречались зоны выраженного полнокровия сосудов, немногочисленные зоны дистрофии и деструкции мышечных волокон, нетипичные для контрольной группы (n=3), разрастание соединительной ткани. В образцах миометрия пациенток сравниваемых групп признаков острого воспаления с инфильтрацией мышечной ткани лейкоцитами и лимфоцитами не было выявлено. Отмечались лишь незначительные периваскулярные скопления этих клеток. Таким образом, в ходе обзорного и морфометрического гистологического исследования установлена структурная сохранность миометрия у пациенток обеих групп, однако выявлены различия по содержанию крови в сосудах и количеству соединительной ткани. Полнокровие сосудов и разрастание соединительной ткани было более характерным для пациенток основной группы с осложненным акушерско-гинекологическим и соматическим анамнезом.

При проведении иммуногистохимического исследования с верификацией CD3+ (Т-лимфоциты) (рис. 1) распределение и количество меченых Т-лимфоцитов у пациентов сравниваемых групп отличались.

Большая часть Т-лимфоцитов выявлялась вблизи крупных или мелких сосудов - периваскулярно, в виде одиночных клеток или инфильтрата. Инфильтратоподобные скопления Т-лимфоцитов чаще выявлялись в миометрии пациенток основной группы.

С помощью инструментов программы ImageJ 1.46 определяли количество и относительную площадь частиц (%) в поле зрения. Количество CD3-позитивных частиц в поле зрения среза миометрия у пациенток основной группы было на 17% больше, чем у пациенток контрольной группы.

В ходе анализа установлено, что относительная площадь (%) CD68-позитивных клеток (макрофаги) и их отростков в поле зрения среза миометрия у пациенток основной группы была на 19,9% меньше, чем у пациенток контрольной группы.

По данным нашего исследования, B-лимфоциты выявлялись преимущественно в сосудах, в незначительном количестве. Морфометрический анализ не определил статистически значимых различий между группами ни по количеству, ни по площади CD20-позитивного материала.

Таким образом, по данным иммуногистохимического морфометрического анализа, структурно-функциональное состояние популяции лимфоцитов CD3+ и CD68+ в миометрии пациенток сравниваемых групп статистически значимо различалось. При неблагоприятном дородовом анамнезе наблюдались активация Т-лимфоцитов и снижение активности тканевых макрофагов. Это свидетельствует о том, что после родоразрешения могут различаться и условия восстановления миометрия. У пациенток основной группы снижается неспецифическая реакция (макрофагальный дифферон) на повреждение и происходит усиление клеточной иммунологической реактивности. Материальная основа гуморального иммунитета (B-лимфоциты) не изменяется.

Иммуногистохимическое исследование актина позволило установить, что в основной группе показатель площади актинпозитивных структур в различных полях зрения и у разных пациенток существенно варьирует (Min-Max) - от 15 до 82%, в контрольной группе - от 50 до 80%. Центральные тенденции (медиана) этого показателя незначительно (на 5,5%), но статистически значимо (p<0,05) различались. Все это свидетельствовало о том, что при неблагоприятном дородовом анамнезе у пациенток группы высокого риска развития инфекционно-воспалительных послеродовых заболеваний структурно-функциональная основа сократительной функции миометрия страдает. На единицу площади/объема миометрия у пациенток этой группы выявлялось меньше актина. Особенно различались крайние варианты вариационных рядов (на 37%). Определение качественных изменений актина (комплекса актин-меченые вторичные антитела) на иммуногистохимических препаратах проводилось путем анализа гистограмм пиксельного состава изображений в различных зонах скопления актина и соединительной ткани. Анализ гистограмм распределения пикселей в зонах мышечной ткани на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, показал практически полную идентичность показателей (среднее, мода) для градаций серого и основных цветов у пациенток основной и контрольной групп. Это подтверждает данные анализа иммуногистохимических препаратов и свидетельствует об одинаковых тинкториальных свойствах мышечных волокон в сравниваемых группах.

При сравнении целых полей зрения, а не отдельных фрагментов миометрия, выявлялись статистически значимые различия по содержанию светлых/темных пикселей. У пациенток контрольной группы было больше темных пикселей (мода - 100), соответствующих актинпозитивной мышечной ткани. По цветовому составу пиксели изображения не различались. Следовательно, у этих пациенток в миометрии доля соединительной ткани была меньше, чем у основной группы.

Вероятно, это связано с тем, что при наличии факторов инфекционного риска, воздействующих до беременности и во время нее, миометрий подвергается дополнительному патологическому воздействию активированных Т-лимфоцитов (относительная площадь CD3-позитивных структур на 21% больше, чем в контрольной группе), что приводит к аутоиммунному повреждению миоцитов на фоне снижения защитной функции тканевых макрофагов (относительная площадь CD68-позитивных структур на 19,9% меньше, чем в контрольной группе) и последующему замещению их соединительной тканью. Подобные изменения мышечной ткани могут стать причиной появления условий для нарушения инволютивных процессов в миометрии в послеродовом/послеоперационном периоде с последующим присоединением патогенной микрофлоры и развитием послеродового эндометрита.

При гистологическом исследовании плацент у родильниц основной группы отмечался высокий процент воспалительных изменений (76,7%). При этом серозный париетальный децидуит выявлялся в 11,1% случаев, на втором месте по распространенности был серозный хориоамнионит (10%). Гнойный париетальный децидуит составил 8,9%, серозный мембранит - 7,8%, серозный базальный децидуит - 6,7%, продуктивный виллузит - 5,6%, фуникуллит - 5,6%, гнойный базальный децидуит - 5,6%. Воспалительные изменения сочетались с дистрофическими и дисциркуляторными процессами в тканях плаценты (27,8%), кальцинатами (18,9%), облитерационной ангиопатией (17,8%), склерозом стромы ворсин (12,2%), псевдоинфарктами (11,1%), очаговым тромбозом (10%). Кроме того, отмечалось наличие выраженных компенсаторных изменений в 64,4% случаев, которые были направлены на улучшение обмена между организмами матери и плода.

1. У родильниц группы высокого риска развития инфекционно-воспалительных послеродовых заболеваний наблюдается системная активация фагоцитоза на фоне снижения неспецифического противовирусного ответа иммунной системы вследствие высокой антигенной нагрузки в результате перенесенных во время беременности воспалительных заболеваний генитального тракта или обострения соматических хронических инфекционных заболеваний.

2. Активация Т-лимфоцитов (CD3+) в миометрии у пациенток основной группы на фоне снижения защитной функции тканевых макрофагов (CD68) способствует появлению небольших очагов дистрофии гладких мышечных клеток, разрастанию соединительной ткани, что в послеродовом периоде приводит к снижению контрактильных свойств матки.