Молекулярные аспекты гиперпластических процессов в эндометрии

Гиперпластические процессы в эндометрии (ГПЭ) характеризуются избыточным ростом и аномальной пролиферацией эндометриальных желез, приводящими к нарушению координации между эпителиальным и стромальным компонентами. При данной патологии возникают комплексные нарушения, сопровождающиеся локальной воспалительной реакцией, усиленным ангиогенезом, высоким пролиферативным потенциалом, а также системной иммуносупрессией. Патофизиология ГПЭ сложна и изучена не полностью. ГПЭ рассматриваются как результат нарушения равновесия между процессами пролиферации и апоптоза клеток, которые регулируются клеточными и внеклеточными компонентами на молекулярном уровне.

В эндометрии, как и в других органах репродуктивной системы женщины, отмечается эстрогенстимулируемая пролиферация клеток, и в этом смысле эстрогены являются своеобразными регуляторами эстрогензависимых генов. Эстрогены по-разному действуют на клетки. Во-первых, существуют два генетически разных типа рецепторов к эстрогенам. Во-вторых, в разных клетках имеются разные кофакторы этих рецепторов, в связи с чем на клетках одних типов эстрогены действуют как агонисты рецепторов, а на других - как антагонисты. Таким образом, клеточный ответ на эстрогены может модулироваться и определяться белковыми факторами, межклеточными, внутриклеточными и клеточно-матриксными взаимоотношениями. Повторяющиеся циклы эстрогениндуцированных делений клеток в репродуктивном периоде (менструальный цикл женщины) создают предпосылки и своеобразную тенденцию к развитию опухолей - эстрогены могут стимулировать деление клеток эндометрия, которые имели какие-либо мутации в ДНК, либо их приобрели [2].

Как известно, помимо эстрогенов, активаторами пролиферативной активности эндометрия являются факторы роста (IGF-1, EGF, TGFα), а также факторы пролиферации (PCNA, Ki-67), необходимые для репликации геномной ДНК. Проведенные ранее исследования показали, что при сложной гиперплазии эндометрия экспрессия ядерного маркера пролиферации Ki-67 и индекс пролиферативной активности достоверно выше, чем при простой гиперплазии без атипии. Кроме того, при сложной гиперплазии с атипией и без атипии отмечены высокая продукция и накопление сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР), что указывает на активные процессы ангиогенеза и высокий риск малигнизации [1].

Изменение синтеза и баланса цитокинов не только прямо или опосредованно влияет на процессы пролиферации и запрограммированной гибели клеток, но может стать и причиной нарушения иммунопоэза. Имеется мнение, что характерной особенностью рецидивирующих ГПЭ является формирование иммунодефицитного состояния, которое определяет исход заболевания.

При анализе молекулярных основ развития ГПЭ в настоящее время большое внимание уделяется состоянию экстрацеллюлярного матрикса, а также ферментам, участвующим в его модификации.

Целью нашего исследования явилось определение роли лизилоксидазы в генезе ГПЭ.

Лизилоксидаза (LOX) - это медьсодержащая аминооксидаза, принадлежащая к семейству, состоящему по последним данным из пяти членов: LOX и лизилоксидазоподобных протеинов - LOXL, LOXL2, LOXL3, LOXL4. Наиболее изученной является сама LOX. Ее основной функцией является инициирование образования межмолекулярных кросс-сшивок в коллагене и эластине, что ведет к повышению прочности и упругости волокон, а также к формированию целостной структуры этих волокон. Таким образом, LOX совершенно необходима для нормальной жизнедеятельности организма.

Доказано, что LOX участвует в контроле за внутриклеточной активностью. Кроме того, высокая внутриядерная активность LOX связана с ее ролью в модификации внеклеточного матрикса и это дает возможность предположить, что этот белок может быть мессенджером (от англ. message - раздражение, передаваемое по нерву), переносящим информацию между внутренним содержимым и окружением клетки, т.е. участвовать в клеточно-матриксном взаимодействии.

Показано, что экспрессия LOX значимо увеличивается при гипоксии, при этом установлена связь между экспрессией LOX и гипоксией индуцирующего фактора (HIF). HIF относится к семейству транскрипционных факторов и индуцирует адаптивный фенотип клетки в ответ на гипоксию. Когда клетки находятся в условиях хронического кислородного голодания, их защитные свойства могут ослабевать, в результате чего происходит их апоптоз. HIF-1 регулирует вазодилатацию, гликолиз, ангиогенез и усиление оксигенации крови.

Состояние гипоксии является характерным признаком клеточного метаболизма в очагах воспаления и травматического повреждения. Следовательно, ядерный фактор HIF-1 и LOX может быть еще одним связующим компонентом между гиперпластическими процессами в эндометрии и опухолеобразованием.

Экспрессию LOX определяли с помощью иммуногистохимического исследования, которое проводилось методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием специфических поликлональных антител к LOX на парафиновых срезах.

Из парафиновых блоков на ротационном микротоме Leitz 1512 изготавливали срезы толщиной 5 мкм. Для монтирования срезов использовали предметные стекла с адгезивным покрытием. Перед окрашиванием парафиновые срезы избавляли от парафина (депарафинизация) путем двукратного погружения стекол на 10 мин сначала в ксилол, а затем в изопропиловый спирт. После этого образцы поочередно погружали на 10 мин в 95% и 70% растворы этанола. Высушивали на воздухе. Для блокирования неспецифического связывания антител срезы инкубировали 50 мин с 1% раствором бычьего сывороточного альбумина. После пятикратного промывания срезов в TBST проводили инкубацию с первичными антителами в течение 50 мин во влажной камере. В качестве первичных антител использовали коммерческие кроличьи поликлональные аффинноочищенные антитела к лизилоксидазе (разведение 1:100). После пятикратного промывания срезов в TBST использовали вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные с флуоресцентной меткой Alexa Fluor 488 (разведение 1:1000) в темноте при комнатной температуре в течение 50 мин. На заключительном этапе реакции срезы инкубировали в течение 10 мин с DAPI в концентрации

1 мкг/мл для окраски ядер. Оценка результатов проводилась на флуоресцентном микроскопе Nikon Diaphot 300 (увеличение 20, 40, 100). Осуществляли подсчет клеток, содержащих LOX, в единице поля зрения, равной 0, 0384 мм², в 3 различных областях среза.

В группу исследования были включены 66 женщин, которые поступили в гинекологическое отделение для проведения гистероскопии и раздельного диагностического выскабливания стенок полости матки. Ретроспективно после получения результатов гистологического исследования соскобов из цервикального канала и полости матки все женщины были разделены на 3 группы: 1-я группа - 22 пациентки, у которых по данным морфологического исследования патологии эндометрия не выявлено; 2-я группа - 24 женщины с железисто-кистозной гиперплазией эндометрия (простая и сложная без атипии); 3-я группа - 20 женщин с простой и сложной гиперплазией эндометрия с атипией.

Все пациентки находились в перименопаузе, средний возраст - 47,8 года. Показаниями к госпитализации явились эхографические признаки гиперплазии эндометрия (9,1%) и маточные кровотечения (90,9%).

Средний возраст наступления менархе составил 12,8 года. При анализе репродуктивной функции во 2-й и 3-й группах отмечено большее количество случаев самопроизвольного или искусственного прерывания беременности, чем в 1-й группе.

Среди перенесенных гинекологических заболеваний (табл. 1)

Сопутствующая экстрагенитальная патология отмечена также у всех женщин (табл. 2).

По данным морфологического исследования, у пациенток с гиперплазией эндометрия без атипии простая форма гиперплазии имелась в 58,3% случаев, сложная - в 41,7%. В 3-й группе у 14 (70%) женщин выявлена простая гиперплазия с атипией, у 6 (30%) - сложная гиперплазия с атипией.

Таким образом, анализ анамнестических данных позволил выделить следующие факторы, предрасполагающие к развитию гиперпластических процессов в эндометрии: нарушение гормонального статуса, наличие персистирующей бактериальной и вирусной инфекции, механические повреждения эндометрия вследствие травматичных внутриматочных диагностических и лечебных манипуляций.

Результаты иммуногистохимического исследования. У пациенток всех групп клетки, в которых располагалась LOX, имели сегментированное ядро, а LOX локализовалась в цитоплазме.

В образцах соскобов эндометрия у обследованных 3-й группы отмечалось увеличение количества клеток (по сравнению с образцами таковых в 1-й и 2-й группах), содержащих в цитоплазме LOX в стромальном компоненте, которое составляло 50 клеток на единицу измерения (рис. 1, 2).

Выявлено, что в соскобах эндометрия пациенток 1-й и 2-й групп не существует разницы в количестве клеток, содержащих LOX. Количество этих клеток составило в среднем 30 на единицу поля, равного 0,0384 мм² (рис. 3-8).

Учитывая плейотропные воздействия LOX на ангиогенез и инвазию, его высокую экспрессию в атипических клетках эндометрия, низкую экспрессию LOX в нормальном эндометрии, можно предположить, что LOX представляет собой мишень для терапии.

Полученные нами результаты определяют новый круг вопросов и предполагают новые научные исследования, которые в дальнейшем помогут пересмотреть традиционные взгляды на этиологию, патогенез и лечение гиперпластических процессов в эндометрии.

1. Результаты иммуногистохимического исследования не выявили принципиального различия в продукции и накоплении LOX при простой и сложной морфологических формах гиперплазии эндометрия без атипии.

2. Достоверно высокий уровень экспрессии LOX у пациенток с атипической гиперплазией эндометрия свидетельствует о наличии клеточной гипоксии и нарушении межклеточного и клеточно-матриксного взаимодействия в ткани эндометрия.

3. Женщины со сложной и простой гиперплазией с атипией относятся к группе высокого риска возможной малигнизации.