Введение

Коронарный атеросклероз — многофакторное заболевание воспалительного генеза, длительно развивающееся и имеющее различные клинические проявления от бессимптомного до стабильной стенокардии, острого коронарного синдрома, сердечной недостаточности. Атеросклеротические поражения (бляшки) коронарных артерий характеризуются высокой степенью гетерогенности в отношении их морфологии и состава, что может влиять на прогрессирование патологического атеросклеротического процесса. Поэтому ранняя диагностика коронарного атеросклероза имеет большое значение, особенно до разрыва бляшки, который может привести к развитию острого коронарного синдрома или острому инфаркту миокарда.

Атеросклероз включает в себя ряд патологических процессов, в частности эндотелиальную дисфункцию, обширное отложение липидов в интиме, обострение врожденных и адаптивных иммунных реакций, пролиферацию гладкомышечных клеток и ремоделирование внеклеточного матрикса, приводящие в итоге к образованию атеросклеротической бляшки.

Для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний большое значение имеют белки острой фазы и белки, участвующие в реализации иммунного ответа организма. Роль церулоплазмина в патогенезе атеросклероза противоречива. Большинство исследований подтверждают связь между повышенным уровнем церулоплазмина и сердечно-сосудистыми заболеваниями [1, 2]. Но остается вопрос, связан ли церулоплазмин с дестабилизацией атеросклеротической бляшки?

Белки острой фазы, ассоциированные с системным воспалением, гаптоглобин, гемоглобин, серотрансферрин и гемопексин участвуют в гомеостазе железа в организме. Известно, что железо накапливается в атеросклеротических бляшках и пораженных участках артерий [3]. В исследовании китайской популяции показано, что гипертоники с более высоким уровнем гаптоглобина имели более тяжелую форму ишемической болезни сердца (ИБС) [4]. При исследовании атеросклеротических бляшек выяснили, что в атеромах мужчин содержатся более высокие уровни ферритина и рецептора трансферрина 1-го типа, но низкие уровни серотрансферрина и гемопексина по сравнению с атеромами женщин [5].

При заболеваниях, в том числе сердечно-сосудистых, одними из первых изменяются белки, участвующие в реализации иммунного ответа организма. Система комплемента является важным компонентом врожденного иммунитета. Исследования показывают активацию системы комплемента при атеросклерозе [3, 6].

Количественный протеомный анализ, используемый для идентификации и определения биологических молекул на основе масс-спектрометрии, является методом с точным количественным одновременным определением большого количества белков в различных биологических образцах. Мониторинг множественных реакций (MRM) с пептидами внутреннего стандарта, мечеными стабильными изотопами, является наиболее широко используемым методом абсолютного количественного анализа белков-мишеней в области протеомики [7, 8]. Понимание изменений белковой составляющей крови при коронарном атеросклерозе поможет выявить новые биомаркеры для лучшего понимания условий развития осложнений данного заболевания.

Цель исследования — изучить ассоциации некоторых белков крови с наличием нестабильных атеросклеротических бляшек у пациентов с коронарным атеросклерозом.

Материал и методы

В исследование включены пациенты с ИБС и коронарным атеросклерозом, поступившие на операцию коронарного шунтирования, которым в ходе операции по интраоперационным показаниям проведена эндартерэктомия из коронарных артерий. Критерии исключения: инфаркт миокарда менее чем за 6 месяцев до исследования, острые хронические инфекционно-воспалительные заболевания или их обострение, почечная недостаточность, активные заболевания печени, рак, гиперпаратиреоз. Протокол исследования одобрен этическим комитетом НИИТПМ — филиала ИЦиГ СО РАН (протокол №7 от 26.09.17). Все участники подписывали информированное добровольное согласие на участие в исследовании. Материал исследования — образцы сыворотки крови. У всех пациентов кровь забирали из локтевой вены утром натощак.

Для количественного протеомного анализа отобраны образцы сыворотки крови 40 мужчин. Все образцы пациентов поделены на две группы. Первая группа (St) — 20 пациентов, у которых, по данным гистологического анализа, в образцах атеросклеротических бляшек (АБ) были только стабильные АБ, средний возраст пациентов — 58,50±4,25 года. Вторую группу (Ns) составили 20 пациентов, у которых, по данным гистологического анализа, в образцах атеросклеротических бляшек были только нестабильные АБ, средний возраст составил 57,40±9,79 года.

Подготовка образцов

Определение концентрации белков в образцах сыворотки крови проводили с помощью стандартного набора PeptiQuant Plus Proteomics Kit (Cambridge Isotope Laboratories, США) согласно инструкции производителя.

Для проведения трипсинолиза в растворе к 10 мкл образца сыворотки крови добавляли 20 мкл раствора, содержащего 9 М мочевины, 20 мМ дитиотрейтола, 300 мМ Трис-HCl (pH 8.0). В отдельную пробирку вносили 10 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА), используемого в дальнейшем в качестве раствора матрицы для точек калибровки. Образцы инкубировали 30 мин при 37 °C. Во все пробирки вносили по 20 мкл раствора 100 мМ йодацетамида. Инкубировали 30 мин в темноте при комнатной температуре. Добавляли 272 мкл 100 мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 35 мкл раствора трипсина. Инкубировали 18 ч при 37 °C. Протеолиз останавливали внесением 343 мкл 2% муравьиной кислоты.

Смесь легких (немеченых) пептидов разводили в 60 мкл раствора 30% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты. Приготовили серию разведений для калибровки по схеме. Смесь пептидов, меченых тяжелыми стабильными изотопами, разводили в 450 мкл 30% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты и использовали в качестве внутреннего стандарта.

В пробирки вносили по 40 мкл образцов сыворотки после трипсинолиза и по 40 мкл раствора БСА после трипсинолиза. Во все пробирки вносили по 10 мкл раствора меченых пептидов. В пробирки с БСА добавляли по 10 мкл соответствующего разведения стандартов для калибровочной кривой. В пробирки с образцами сыворотки вносили по 10 мкл раствора 30% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты. Во все пробирки добавляли по 540 мкл 0,1% муравьиной кислоты.

Очистку образцов проводили на картриджах для твердофазной экстракции Oasis HLB (Waters Corporation, США), 10 мг. Картриджи активировали 600 мкл метанола и уравновесили 600 мкл 0,1% муравьиной кислоты. Вносили по 510 мкл образца, промывали 600 мкл воды 3 раза. Пептиды элюировали с помощью 300 мкл раствора 50% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты. Полученные образцы замораживали при –80 °C и высушивали с помощью лиофильной сушки FreeZone 2.5 (Labconco Corporation, США). Сухие осадки разводили в 34 мкл 0,1% муравьиной кислоты и использовали для анализа.

Масс-спектрометрия

Детекцию пептидов осуществляли методом мониторинга множественных реакций (MRM) на масс-спектрометре Q-TRAP 6500 (AB Sciex Pte. Ltd., США), комбинированном с жидкостным хроматографом Infinity 1290 (Agilent Technologies, Inc., США). Хроматографическое разделение проводили на колонке HPLC Column Supelco Titan C18 100 × 2.1 mm 1.9 um (Supelco, США) в несколько этапов: 0—40 мин — от 2% до 23% фазы B, 40—43 мин — от 23% до 45%, 43—43,5 мин — от 45 до 80%, 43,5—45,5 мин — 80% фазы B, 45,5—46 мин — от 80% до 2%, 46—50 мин — 2% фазы B. Подвижная фаза A: 99,9% — вода, 0,1% — муравьиная кислота; фаза B: 99,9% — ацетонитрил, 0,1% — муравьиная кислота. Скорость потока — 0,4 мл/мин, температура разделения — 45 °C, объем закола 10 мкл.

Детектировали положительно заряженные ионы, полученные с помощью ионизации электроспреем в источнике Turbo Spray IonDrive. Построение калибровочных кривых и определение концентрации белков осуществляли в программе MultiQuant 3.0.2 (AB Sciex, США) по площади пиков MRM-переходов, специфичных для каждого исследованного пептида.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы SPSS 23.0 для Windows (SPSS Inc., США). Статистический анализ включал тест на нормальность распределения признаков Колмогорова—Смирнова, сравнительный анализ One Way Anova между группами с использованием t-критерия Стьюдента для нормально распределенных переменных или сравнительный анализ Манна—Уитни для ненормально распределенных переменных. Для улучшения восприятия данных результаты в таблице приведены в виде средних значений и стандартного квадратичного отклонения переменных (Mean±SD). С целью поиска ассоциаций проведен многофакторный логистический регрессионный анализ, где в качестве зависимой была переменная «стабильные/нестабильные бляшки», а в качестве независимых переменных включены изучаемые белки небольшими группами. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Концентрацию белков в образцах сыворотки крови измеряли с помощью набора PeptiQuant Plus Proteomics Kit (Cambridge Isotope Laboratories, США) на 125 белков. Идентификацию белков осуществляли методом мониторинга множественных реакций на тройном квадруполь-времяпролетном масс-спектрометре сверхвысокого разрешения, комбинированном с высокоэффективным жидкостным хроматографом.

Анализ дифференциальной экспрессии белков проведен по двум техническим повторам каждого образца. В результате сравнительного анализа выделены белки, концентрация которых статистически значимо различалась в исследуемых группах (p<0,05).

Содержание основного белка сыворотки крови, сывороточного альбумина в группе образцов с нестабильными бляшками было меньше, но статистическая значимость не достигнута (см. таблицу).

Концентрация белков в образцах крови

Для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний большое значение имеют белки острой фазы и белки, участвующие в реализации иммунного ответа организма.

В нашем исследовании концентрация церулоплазмина в крови в группе пациентов с нестабильными бляшками была ниже на 13% (p<0,05) по сравнению с группой со стабильными бляшками (см. таблицу).

В исследуемых группах содержание гаптоглобина и гемопексина в крови значительно отличалось (на 29 и 21% соответственно), при этом концентрация гемоглобина (subunit alpha) в крови у пациентов группы Ns также снижалась, но статистической значимости не достигла. Концентрация циркулирующего серотрансферрина у пациентов группы Ns была на 9% ниже, чем у пациентов группы St, что согласуется с более низким уровнем гемоглобина у пациентов группы Ns.

Кроме того, при заболевании одними из первых изменяются белки, участвующие в реализации иммунного ответа организма. Система комплемента является важным компонентом врожденного иммунитета.

В нашем исследовании значимой разницы между субкомпонентами C1 (C1q; C1r; С1s) в исследуемых группах не обнаружено. Но суммарно содержание субкомпонентов комплемента C1 в крови было выше у пациентов группы St (471,37 fmol/µl), чем у пациентов группы Ns (446,48 fmol/µl), p<0,0001. А концентрация компонентов комплемента C3, C7, C9 и фактора комплемента B была выше у пациентов группы St (p<0,05). Уровень фактора комплемента H, принимающий участие в инактивации C3b, был ниже на 8% у пациентов этой группы (см. таблицу).

Кроме того, многофакторный логистический анализ показал, что нестабильность атеросклеротических бляшек ассоциирована с концентрацией компонентов комплемента C3 (Exp(B)=1,014; ДИ 1,003—1,026; p=0,016), C7 (Exp(B)=0,948; ДИ 0,911—0,985; p=0,007), C9 (Exp(B)=1,039; ДИ 1,004—1,076; p=0,030), фактор H (Exp(B)=1,031; ДИ 1,008—1,055; p=0,009).

Еще одним белком, участвующим в реализации иммунного ответа организма, является аттрактин, который экспрессируется на моноцитах периферической крови человека и высвобождается активированными Т-клетками. В группе образцов Ns концентрация аттрактина в крови была выше на 14%, а многофакторный логистический анализ показал связь нестабильности атеросклеротических бляшек с концентрацией аттрактина (Exp(B)=1,045; ДИ 1,005—1,086; p=0,027).

Кроме того, сравнительный анализ в исследуемых группах показал значительную разницу в содержании в сыворотке крови транспортного белка афамина, носителя витамина E. У пациентов со стабильными бляшками концентрация афамина составила 330,12±117,85 fmol/µl, а у пациентов с нестабильными бляшками концентрация афамина была в 1,25 раза меньше, чем у пациентов группы St (см. таблицу). При этом многофакторный логистический анализ показал связь нестабильности атеросклеротических бляшек с концентрацией афамина (Exp(B)=0,988; ДИ 0,981—0,994; p=0,0001).

Обсуждение

Повышенные концентрации и церулоплазмина, и меди независимо связаны с повышенным риском смертности от всех причин и от сердечно-сосудистых причин в частности [2]. Гликопротеин церулоплазмин относится к белкам острой фазы и обладает как провоспалительными, так и антивоспалительными свойствами, поэтому его роль в патогенезе атеросклероза противоречива. Большинство исследований подтверждают прямую связь между повышенным уровнем церулоплазмина и частотой ИБС [1]. Кроме того, повышенный уровень церулоплазмина в сыворотке связывают с неблагоприятным долгосрочным прогнозом, таким как высокий риск инфаркта миокарда [9]. Но неизвестно, связан ли церулоплазмин с дестабилизацией атеросклеротической бляшки.

В нашем исследовании концентрация церулоплазмина в крови в группе пациентов с нестабильными бляшками снижалась по сравнению с группой со стабильными бляшками.

Еще одним белком острой фазы, который индуцируется при системном воспалении, является гаптоглобин. Известно, что уровень гаптоглобина в плазме связан со многими воспалительными заболеваниями, включая сердечно-сосудистые. В исследовании китайской популяции показано, что генетический вариант гаптоглобина не связан с тяжестью ИБС и смертностью в общей популяции, но гипертоники с аллелем T rs217181 и с более высоким уровнем гаптоглобина имели более тяжелую форму ИБС [4]. Гаптоглобин, гемоглобин, серотрансферрин и гемопексин участвуют в гомеостазе железа в организме. Кроме того, железо накапливается в атеросклеротических бляшках и пораженных участках артерий, в каталитически активной форме способно вызывать проатерогенные события, такие как производство активных форм кислорода и перикисное окисление липидов [3]. Ранее показано, что в атеросклеротических бляшках мужчин обнаружены крупные очаги некроза и большое количество разрывов бляшек, что связывают с более высоким уровнем гемоглобина в крови [5]. При исследовании гендерных различий в атеросклеротических очагах выяснили, что в атеромах у мужчин имеются более высокие уровни ферритина и рецептора трансферрина 1-го типа в очагах поражения, но низкие уровни серотрансферрина и гемопексина в сравнении с атеромами у женщин [5]. Гемопексин способен связывать гемоглобин, защищая от возможных окислительных повреждений, концентрация его возрастает при воспалении [10]. Гемсвязывающий гемопексин некоторые исследователи рассматривают как защитный белок в этом процессе, хотя до конца его роль в атеросклерозе не выяснена [11].

В наших исследуемых группах концентрации гаптоглобина, гемопексина, серотрансферрина и гемоглобина (subunit alpha) в крови в группе пациентов Ns снижались, при этом в первых трех случаях достигнута статистическая значимость.

Возможно, снижение уровней белков острой фазы связано с более выраженным воспалительным процессом у пациентов со стабильными фиброзными бляшками в коронарных артериях.

Кроме того, при заболевании одними из первых изменяются белки, участвующие в реализации иммунного ответа организма. Система комплемента является важным компонентом врожденного иммунитета. Последовательные реакции протеолитической активации компонентов системы комплемента (C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C9) принимают участие в развитии воспалительного процесса. Многие исследования показывают активацию системы комплемента при атеросклерозе [3, 6]. Особенное значение придают активации компонента C3, в которой сходятся различные пути системы комплемента, с образованием активных протеолитических продуктов C3, конвертаз C5 и активации терминальных белков комплемента от C5 до C9, и образованию мембраноатакующего комплекса. Обнаружение отложений C3b/iC3b и компонентов мембраноатакующего комплекса в атеросклеротических артериях указывает на повышенную активацию комплемента [6]. Ранее проведенные исследования показали высокие уровни C5b-9 в утолщении интимы и фиброзных бляшках по сравнению с нормальной тканью. При этом уровни C5b-9 в утолщениях интимы были выше, чем в фиброзных бляшках, что позволило авторам предположить, что активация комплемента происходит непосредственно в стенке артерии и является активной частью атерогенеза [3].

В нашем исследовании концентрации в крови компонентов комплемента C3, C7, C9 и фактора комплемента B были выше у пациентов группы St. Но уровень фактора комплемента H, принимающий участие в инактивации C3b, снижался у пациентов этой группы. Кроме того, многофакторный логистический анализ показал связь нестабильности атеросклеротических бляшек с концентрацией компонентов комплемента C3, C7, C9 и фактора H.

Аттрактин также является белком, участвующим в реализации иммунного ответа организма, в частности, в начальной кластеризации иммунных клеток Т-клеток во время воспалительной реакции [12]. В исследуемой группе образцов Ns концентрация аттрактина в крови была значительно выше, а многофакторный логистический анализ показал связь нестабильности атеросклеротических бляшек с концентрацией аттрактина.

Афамин может играть роль носителя витамина E, одного из основных антиоксидантов организма в плазме. Анализ связывания радиолигандов продемонстрировал in vitro специфическое сродство афамина к связыванию как с α-токоферолом, так и с γ-токоферолом, двумя наиболее важными формами витамина E [13].

Сравнительный анализ в исследуемых группах показал значительную разницу в содержании в сыворотке крови афамина. В группе пациентов с нестабильными бляшками концентрация афамина была в 1,25 раза меньше, чем в группе St, а многофакторный логистический анализ показал связь нестабильности атеросклеротических бляшек с концентрацией афамина.

Заключение

Определение потенциальной роли исследованных белков в развитии коронарного атеросклероза, а также их прогностической ценности в качестве биомаркеров нестабильности атеросклеротических бляшек должно стать предметом дальнейших исследований.

Результаты этого исследования, полученные с помощью современного метода масс-спектрометрии, выявили в образцах сыворотки крови у пациентов с нестабильными атеросклеротическими бляшками повышенные концентрации белков аттрактина и субкомпонента комплемента фактора H, а также сниженное содержание белков, участвующих в развитии воспалительного процесса и реализации иммунного ответа организма, таких как церулоплазмин, гемопексин, гаптоглобин, афамин, компоненты комплемента (C3, C7, C9), и фактора комплемента B.

Многофакторный логистический регрессионный анализ подтвердил связь нестабильности с концентрацией аттрактина (Exp(B)=1,045; p=0,027), афамина (Exp(B)=0,988; p=0,001), гемопексина (Exp(B)=0,997; p=0,020), гаптоглобина (Exp(B)=0,967; p=0,001) и компонентов системы комплемента. Возможно, в будущем повышенная концентрация этих белков в крови будет рассматриваться как перспективный циркулирующий биомаркер нестабильности атеросклеротических бляшек при коронарном атеросклерозе.

Данное исследование представляет собой потенциальную протеомную платформу для дальнейших исследований нестабильности бляшек при атеросклерозе.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Работа выполнена в рамках бюджетной темы по Государственному заданию №122031700094-5 и в рамках гранта Президента Российской Федерации №МК-1641.2022.3.