Нормальное развитие гестации зависит от сбалансированного функционирования системы мать—плацента—плод, важную роль в которой играет плацента. Дисфункция плаценты занимает ведущее место среди факторов, осложняющих беременность, и ее частота до настоящего времени остается достаточно высокой [1, 2]. Это обосновывает актуальность дальнейшего исследования клеточно-молекулярных механизмов развития данной акушерской патологии. В регуляции многих метаболических процессов принимают активное участие окислительные и восстановительные реакции, дисбаланс между которыми приводит к существенным негативным последствиям [3—5]. Наряду с теоретической ценностью изучения редокс-процессов при осложненной беременности значение таких исследований обусловлено возможностью использования полученных данных в диагностических и прогностических целях в качестве критериев оценки развития патологии. Особую важность состояние редокс-процессов имеет в период беременности в связи с необходимостью обеспечения трофических и энергетических потребностей не только материнского организма, но и плода, следовательно, для нормального течения и исхода беременности.

Цель исследования — изучить плацентарную активность про- и антиоксидантных ферментов, а также оценить экспрессию белков, регулирующих окислительно-восстановительные процессы, при физиологической беременности и дисфункции плаценты.

В проспективное исследование включены 60 женщин в возрасте 24—30 лет, составивших две группы: 1-я (контрольная) группа представлена 28 клинически здоровыми женщинами с неосложненным течением беременности и родов. Во 2-ю (основная) группу вошли 32 женщины, беременность которых осложнилась дисфункцией плаценты, верифицированной после родов. По возрасту, индексу массы тела, соматическому, акушерско-гинекологическому анамнезу, паритету беременностей и родов женщины обеих групп сопоставимы. В обеих группах преобладали первородящие женщины: в контрольной группе они составили 59,4%, в основной — 60,2%. В анамнезе прерывание беременности по желанию женщины выполнялось в 21,9 и 22,7% случаев соответственно в контрольной и основной группах. Самопроизвольных патологических прерываний беременности у всех пациенток не было. Наличие хронических заболеваний имело место в 18,7 и 19,3% случаев соответственно. Обследованные пациентки наблюдались в консультативной поликлинике Научно-исследовательского института акушерства и педиатрии ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России в рамках программы «Акушерский мониторинг». Исследование проводилось с учетом требований Хельсинкской декларации (2008) и Правил надлежащей клинической практики, утвержденных приказом Минздрава Российской Федерации от 01.04.16 № 200н «Об утверждении правил надлежащей клинической практики» [6] и одобрено этическим комитетом Научно-исследовательского института акушерства и педиатрии ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России. Все беременные, принявшие участие в исследовании, подписали информированное согласие.

Критерии исключения: инфекционные заболевания, декомпенсированные формы соматических заболеваний, многоплодная и недоношенная беременность, признаки преэклампсии и задержки роста плода, аутоиммунная патология, отсутствие информированного согласия на расширенный протокол исследования.

Критериями при установлении диагноза и для включения в основную группу служили нарушения кровотока в маточных артериях, сосудах пуповины или магистральных сосудах плода без признаков централизации кровообращения по данным допплерометрии. Выявленные нарушения кровотока соответствовали изменению гемодинамики I степени по классификации А.Н. Стрижакова (1988). Кроме того, у женщин основной группы наблюдались начальные проявления гипоксии плода при кардиотокографии, уменьшение активности специфических плацентарных изоферментов (глутаматдегидрогеназы и термостабильной щелочной фосфатазы), снижение уровня плацентарного лактогена и прогестерона. Отставание роста плода по данным ультразвуковой фетометрии отсутствовало. Гистологическое исследование плаценты, проведенное на парафиновых препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, выявило патологические изменения, являющиеся морфологическими критериями плацентарной недостаточности, — фиброз стромы ворсин, выпадение фибрина, вариант хаотичных склерозированных ворсин и эмбриональных ворсин, участки кальциноза, гиперваскуляризация ворсин, кровоизлияние в строму ворсин.

Материалом для исследования служила ткань плаценты. Образцы плаценты получали сразу после родов при соблюдении холодового режима (2—4 °C). Для проведения исследования брали центральную часть макроскопически нормальных участков плацентарного диска, включая плодовую и материнскую поверхности, не затрагивая крупных сосудов. Отобранные образцы (10 г) промывали охлажденным физиологическим раствором для удаления остатков крови и амниотической жидкости, затем гомогенизировали (при температуре 4 °C) в физиологическом растворе, центрифугировали и в полученных экстрактах плаценты изучали показатели редокс-процессов.

Для суждения о прооксидантных процессах определяли активность оксидазы никотинамидадениндинуклеотидфосфата восстановленного (НАДФН-оксидазы), ксантиноксидазы, которые оценивали с помощью спектрофотометрических методов [7]. Об активности ксантиноксидазы (КФ 1.2.3.2.) судили по усилению степени окисления ксантина и определению уровня образовавшейся мочевой кислоты в ультрафиолетовой области при длине волны 293 нм, используя коэффициент молярной экстинкции 7,59·10³ М^–1 см^–1. Активность НАДФН-оксидазы (КФ 1.11.1.2) определяли по восстановлению 2,6-дихлорфенолиндофенола (2,6-ДХФДФ) в присутствии НАДФН при 600 нм. Коэффициент молярной экстинкции для 2,6-ДХФДФ — 21·10³ М^–1 см.

Состояние антиоксидантной системы оценивали по показателям активности супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионредуктазы (ГР). Активность СОД (КФ 1.1.5.11) определяли по степени торможения реакции восстановления нитросинего тетразолия в результате ферментативной дисмутации генерируемого супероксидного анион-радикала при 540 нм [7]. За единицу активности принимали количество фермента, вызывающее 50% торможение реакции. Об активности каталазы (КФ 1.11.1.6) судили по убыли перекиси водорода (Н₂О₂) при длине волны 230 нм, учитывая коэффициент молярной экстинкции Н₂О₂ — 0,071. Активность глутатион-зависимых ферментов определяли с помощью общепринятых спектрофотометрических методов [8]. Активность ГПО (КФ 1.11.1.9) оценивали в реакции расщепления гидроперекиси третбутила при длине волны 412 нм, используя в качестве субстрата восстановленный глутатион. Активность Г.Р. (КФ 1.6.4.2) измеряли по степени окисления НАДФН при длине волны 340 нм в присутствии окисленного глутатиона.

Об интенсивности свободнорадикального окисления липидов судили по содержанию диеновых конъюгатов и оснований Шиффа. Определение диеновых конъюгатов осуществляли спектрофотометрически при длине волны 233 нм [9] в гептановой фазе экстрагирующей смеси (гептан с изопропиловым спиртом в объемном отношении 1:1). Содержание диеновых конъюгатов рассчитывали, исходя из величины молярного коэффициента, равного 2,2·10⁵ М^–1 см^–1. Основания Шиффа определяли по флюоресценции хлороформных экстрактов из образцов плацентарной ткани при длине волны возбуждения 360 нм и максимума испускания при длине волны 440 нм. Калибровку шкалы флуориметра (RF-5101 «Shimadzu», Япония) строили по стандартному раствору хининсульфата.

Для определения интенсивности дифференциальной экспрессии белков, регулирующих редокс-процессы, проводили протеомный анализ плаценты. Протеомные карты плацентарной ткани получали с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле (приборы Protein IEF Cell и Protean II xi Multi-Cell, «Bio-Rad», США). После завершения электрофореза для визуализации белковых пятен в гелях фореграммы окрашивали азотнокислым серебром, сканировали и анализировали с использованием пакета программ PDQuest («Bio-Rad», США). Идентификацию белков после вырезания пятен из геля и процедуры трипсинолиза проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) на масс-спектрометре Autoflex II («Bruker Daltonik GmbH», Германия) с использованием программы Mascot MS Search («Matrix Science», Великобритания) и баз данных NCBI и Swiss-Prot.

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0 фирмы «StatSoft Inc.», США). Оценка характера распределения данных с помощью критерия Шапиро—Уилка свидетельствует об их нормальном распределении. Показатели активности ферментов представлены в виде среднего значения (M), средней квадратичной ошибки (m) и 95% доверительного интервала (95% ДИ). Для дифференциально-экспрессирующихся белков статистическую значимость различий между сравниваемыми группами оценивали с помощью χ²-критерия. Статистическую значимость различий между сравниваемыми данными определяли по критерию Стьюдента (t-критерий) для независимых выборок. Корреляционный анализ выполнен методом Спирмена с расчетом коэффициента ранговой корреляции (r). Результаты оценивали как статистически значимые при р<0,05.

Проведенные нами исследования свидетельствуют о значительном изменении интенсивности окислительно-восстановительных процессов в плаценте при ее дисфункции по сравнению с аналогичными показателями при физиологической беременности (табл. 1).

Активность антиоксидантных ферментов СОД и каталазы, участвующих в процессах утилизации супероксидного анион-радикала и перекиси водорода, напротив, снижается. Для СОД снижение составляет 53,7%, а для каталазы — 44,2%.

Что касается антиоксидантных ферментов, сопряженных с глутатионом и участвующих в регуляции редокс-зависимых процессов, главным образом, путем поддержания баланса восстановленного и окисленного глутатиона, то их активность также уменьшается в плаценте при ее недостаточности.

Следует подчеркнуть, что указанный баланс — необходимое условие для жизнедеятельности клеток. Восстановленный глутатион, являясь внутриклеточным антиоксидантом, выполняет роль косубстрата в реакциях детоксикации пероксидов, особую роль в которых играет ГПО [10]. Активность ГПО в плаценте женщин основной группы снижается на 38,9% относительно аналогичной величины у женщин контрольной группы, что имеет отрицательные последствия для функционирования плаценты. Выраженное уменьшение активности характерно и для ГР — фермента, восстанавливающего окисленный глутатион в присутствии НАДФН. Такая направленность изменения сопровождается накоплением окисленного глутатиона и, следовательно, нарушением клеточного редокс-статуса и повреждением редокс-зависимой регуляции многих биологически важных процессов в фетоплацентарной системе. Совокупность модификации активности изученных про- и антиоксидантных ферментов при дисфункции плаценты приводит к усилению внутриутробной гипоксии и развитию окислительного стресса, имеющего место при плацентарной недостаточности.

Вышеописанные нарушения активности ферментов способствуют усилению свободнорадикального окисления, важной частью которого является перекисное окисление липидов (ПОЛ). Как показали наши исследования, количество первичных продуктов ПОЛ — диеновых конъюгатов — при дисфункции плаценты увеличивается на 44,9% по сравнению с таковым в плаценте при неосложненной беременности. Содержание конечных продуктов пероксидации — оснований Шиффа — повышено на 37,6%.

Зависимость между показателями ПОЛ, увеличением прооксидантных процессов и снижением антиоксидантных процессов подтверждается результатами корреляционного анализа. Прямая корреляционная связь выявлена между содержанием диеновых конъюгатов и активностью НАДФН-оксидазы (r=0,87; p<0,02), а также активностью ксантиноксидазы (r=0,82; p<0,01). Коэффициенты корреляции между величиной оснований Шиффа, активностью НАДФН-оксидазы и ксантиноксидазы равны соответственно 0,85 (p<0,01) и 0,78 (p<0,01). Для антиоксидантных ферментов СОД и каталазы установлена обратная корреляция с показателями ПОЛ. Коэффициенты корреляции между активностью этих ферментов и содержанием диеновых конъюгатов составляют соответственно –0,88 (p<0,02) и –0,79 (p<0,01). Сопоставление активности СОД с уровнем оснований Шиффа также свидетельствует об отрицательной взаимосвязи между ними: r=–0,83; p<0,01. Для пары каталаза — основания Шиффа коэффициент корреляции равен –0,81 (p<0,01). Отрицательная зависимость установлена между продуктами ПОЛ и глутатионзависимыми ферментами. Величина r между ними находится в пределах –0,79 — –0,75.

Среди причин нарушения окислительно-восстановительных реакций при дисфункции плаценты большое значение могут иметь изменения экспрессии белков, регулирующих интенсивность редокс-процессов, поддерживающих баланс про- и антиоксидантов и влияющих на энергетический обмен в митохондриях. Проведение протеомного анализа позволило выявить и идентифицировать в плаценте при ее дисфункции дифференциально-экспрессирующиеся белки, обладающие перечисленными регуляторными функциями, продукция которых значительно снижена (табл. 2).

В ранее проведенных нами исследованиях протеомный дисбаланс установлен и в околоплодных водах, что предполагает системный характер модификации экспрессии редокс-регулирующих белков при дисфункции плаценты [13]. О системном характере выявленных нарушений свидетельствуют также изменения активности окислительно-восстановительных ферментов в околоплодных водах при плацентарной недостаточности [14].

Приведенные изменения метаболических процессов, происходящие в результате нарушения редокс-процессов, создают условия для формирования дисфункции плаценты. В свою очередь эта акушерская патология приводит к нарушениям в развитии внутриутробного плода и осложнениям в развитии новорожденного. Наблюдение за новорожденными основной группы, которые переведены из родильного блока в отделение патологии и реабилитации новорожденных, показали, что у 15 из них, по данным клинико-функционального обследования [15], включая нейросонографию, появились признаки церебральных нарушений. Изученные показатели окислительно-восстановительных процессов в плаценте могут быть использованы в качестве маркеров прогнозирования постнатальных повреждений при дисфункции плаценты, причем особенно информативными являются активность ксантиноксидазы, СОД и глутатионредуктазы, степень изменения которых наиболее значима.

Полученные данные свидетельствуют о том, что развитие дисфункции плаценты происходит на фоне нарушения баланса окислительно-восстановительных процессов в плаценте. Повышение активности прооксидантных ферментов и снижение активности антиоксидантных ферментов, очевидно, являются важной причиной окислительного стресса и, как следствие, дальнейших метаболических повреждений в плаценте и фетоплацентарном комплексе, имеющих место при этой акушерской патологии. Не менее важными для формирования дисфункции плаценты являются изменения в экспрессии белков, регулирующих редокс-процессы. Данные изменения, поскольку они происходят на уровне генома, могут служить первичными звеньями в цепи молекулярно-биохимических нарушений при дисфункции плаценты.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Погорелова Т.Н..

Сбор и обработка материала — Гунько В.О., Никашина А.А., Аллилуев И.А., Ларичкин А.В..

Статистическая обработка данных — Гунько В.О., Никашина А.А..

Написание текста — Погорелова Т.Н., Палиева Н.В..

Редактирование — Погорелова Т.Н..

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Погорелова Т.Н. — д.б.н., проф., главный научный сотрудник Научно-исследовательского института акушерства и педиатрии ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, Ростов-на-Дону, Россия; e-mail: tnp.rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-0400-0652

Гунько В.О. — к.б.н.; e-mail: rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8607-9052

Никашина А.А. — к.б.н., научный сотрудник Научно-исследовательского института акушерства и педиатрии ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, Ростов-на-Дону, Россия; e-mail: rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-8099-9093

Палиева Н.В. — д.м.н., ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, Ростов-на-Дону, Россия; e-mail: rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0003-2278-5198

Аллилуев И.А. — младший научный сотрудник Научно-исследовательского института акушерства и педиатрии ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, преподаватель кафедры биохимии и микробиологии АБиБ ФГАОУ ВПО «Южный федеральный университет» Минобрнауки России, Ростов-на-Дону, Россия; e-mail: rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-7654-0650

Ларичкин А.В. — ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, Ростов-на-Дону, Россия, e-mail: rniiap@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-1207-0554

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Погорелова Т.Н., Гунько В.О., Никашина А.А., Палиева Н.В., Аллилуев И.А., Ларичкин А.В. Нарушение регуляции редокс-процессов в плаценте при ее дисфункции. Проблемы репродукции. 2019;25(6):-118. https://doi.org/10.17116/repro201925061

Автор, ответственный за переписку: Погорелова Т.Н. —
e-mail: tnp.rniiap@yandex.ru