Последние данные литературы по этиологии и патогенезу немозаичной формы синдрома Клайнфельтера (СК), преимущественное внимание которых было сфокусировано на тех областях, которые наиболее значимы в понимании развития этого заболевания: молекулярных, генетических, физиологических, а также возрастных особенностях, изложены в обзоре литературы «Этиологические и патогенетические аспекты немозаичной формы синдрома Клайнфельтера».

Понимание патофизиологии СК в сочетании с последними достижениями в области репродуктивной медицины значительно изменило перспективы пациентов относительно возможности иметь биологических детей. СК является более распространенным заболеванием, чем врожденный гипотиреоз, адреногенитальный синдром, фенилкетонурия, галактоземия, муковисцидоз, для которых сейчас в Российской Федерации существуют обязательные скрининговые программы [1—3].

Ранее пациентов с немозаичной формой СК (47,XXY) считали абсолютно бесплодными. При морфологическом исследовании тестикулярной ткани у них определяются обширные поля клеток Лейдига, гиалинизированные, а в некоторых случаях склерозированные извитые семенные канальцы. Часто отмечается и полная дегенерация извитых семенных канальцев («тени канальцев»), среди которых могут встречаться семенные канальцы с микроочагами незавершенного сперматогенеза. Мягкая дисфункция клеток Лейдига в большинстве случаев присутствует с самого раннего детства и сохраняется в период половой зрелости. Функция клеток Сертоли чаще всего снижена, а с середины периода полового созревания наблюдается резкое ее ухудшение. Менее чем у 10% мужчин синдром диагностируется до начала пубертата, зачастую имеет место одно- или двусторонний крипторхизм. Иными словами, возможности терапевтического вмешательства до полной утраты эмбриональных клеток очень ограничены.

В последние десятилетия произошло совершенствование методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и внедрение в клиническую практику микрохирургического извлечения сперматозоидов из ткани яичка — микро-ТЕSЕ (microdissection testicular sperm extraction). При этой процедуре используется 20—30-кратное увеличение операционного микроскопа для визуализации единичных расширенных участков извитых семенных канальцев, в которых возможно наличие сохраненного сперматогенеза. В публикациях за последнее время показано, что более чем у 50% пациентов с СК в ходе операции микро-ТЕSЕ удается найти сперматозоиды. Эти цифры сопоставимы с результатами микро-ТЕSЕ у пациентов с необструктивной азооспермией и нормальным кариотипом [3—7]. В 1998 г. G. Palermo и соавт. [8—11] впервые сообщили о нескольких случаях успешного лечения, а за последние 15 лет уже зарегистрированы около 150 детей с нормальным кариотипом, рожденных от мужчин с немозаичной формой СК в программе ЭКО—ИКСИ—микро-ТЕSЕ.

Исходя из вышеизложенного, становится очевидным, что прежний термин «абсолютная стерильность» для пациентов с СК неприменим. Приведенные современные данные, возможно, позволят разрушить врачебный стереотип о «бесполезности» работы с этой когортой пациентов для преодоления бесплодия.

Цель исследования — представить собственные результаты по обследованию, предоперационной подготовке и извлечению сперматозоидов методом микро-ТЕSЕ у пациентов с немозаичной формой СК в программе ЭКО—ИКСИ.

Диагностический комплекс для пациентов с азооспермией включал общеклинические и специальные методы исследования: лабораторные, инструментальные и морфологические. При осмотре проводили оценку общефизического развития, определяли тип телосложения, индекс массы тела (ИМТ) и уровень вирилизации по Таннеру, наличие гинекомастии. В зависимости от индекса выделяли пациентов с нормальной массой тела (ИМТ=18—24,9 кг/м²), избыточной (ИМТ=25—29,9 кг/м²) и ожирением (ИМТ ≥30 кг/м²). Специальное андрологическое исследование включало оценку размеров и состояния яичек (с помощью орхидометра Прадера и при ультразвуковом исследовании органов мошонки), пальпаторное обследование придатков яичек, семявыносящих протоков, полового члена, предстательной железы и семенных пузырьков. Все пациенты относились к группе с гипоплазией (менее 3,0 см³) яичек. Гипогонадизм диагностировался при наличии клинических симптомов, ассоциированных с дефицитом андрогенов в сыворотке крови.

Семиологический анализ проводился по стандартным критериям ВОЗ (5-е издание, 2010). Азооспермия была подтверждена минимум двукратным исследованием эякулята. Гормональный скрининг пациентов включал оценку уровня ФСГ, ЛГ, пролактина, глобулина, связывающего половые стероиды, ингибина В, ТТГ, общего тестостерона, эстрадиола. Исследование кариотипа проводилось по стандартной методике цитогенетического анализа.

Одновременно с забором материала семенных канальцев для оплодотворения при извлечении сперматозоидов проводился забор материала для гистологического исследования тестикулярной ткани. Для оценки состояния сперматогенеза по данным биопсийного материала были использованы две классификации — по шкале McLachlan и соавт. (2007) и Johnsen (1970) в модификации (2014).

В отделении ВРТ ФГБУ ЭНЦ с 2013 по 2017 г. были обследованы 18 пациентов с немозаичной формой СК в возрасте от 15 до 35 лет. Кроме 6 подростков, все мужчины состояли в браке и желали реализовать свою репродуктивную функцию. Верификация диагноза СК у 14 пациентов была проведена в пубертатном периоде, а у 4 мужчин только после обращения в отделение ВРТ с жалобами на ненаступление беременности в браке. Возраст последних составлял от 24 до 32 лет. В программу ЭКО—ИКСИ—микро-ТЕSЕ были включены 4 мужчины в возрасте от 22 до 30 лет и 2 подростка 15 и 16 лет. С целью поиска и извлечения сперматозоидов всем пациентам была проведена микрохирургическая операция билатеральной микродиссекции семенных канальцев (микро-ТЕSЕ).

В ходе операции у юноши 15 лет и мужчины 22 лет были обнаружены сперматозоиды. Единичные сперматозоиды пациента 15 лет были подвергнуты криоконсервации с целью реализации репродуктивной функции в будущем. Извлеченные тестикулярные сперматозоиды пациента 22 лет использовали для оплодотворения ооцитов супруги методом ИКСИ, а также были заморожены.

В зависимости от результата микро-ТЕSЕ пациенты были разделены на две группы (табл. 1): результативную — при извлечении сперматозоидов и нерезультативную — при их отсутствии. Все пациенты имели евнухоидный тип телосложения с уровнем вирилизации по Таннеру 4 балла, крипторхизм не выявлен. Варикоцеле было отмечено по одному случаю в каждой группе.

Между пациентами обеих групп не имелось существенных различий по объему яичек и гормональному статусу.

Согласно данным литературы [12—17], в настоящее время главным и единственным прогностическим фактором для успешной экстракции сперматозоидов в ходе микродиссекции считают возраст до 35 лет.

Ранее считалось, что шанс нахождения сперматозоидов в ходе микро-ТЕSЕ у юношей с СК гораздо выше, чем у взрослых мужчин. Проведено исследование, задачей которого было подтвердить или опровергнуть данное утверждение. Результаты работы отрицают гипотезу, что у пациентов с немозаичной формой СК в начале пубертата шансы на положительный исход микро-ТЕSЕ выше, чем у взрослых мужчин [18].

Выборка наших пациентов мала, чтобы сделать конкретный вывод, но мы отметили тенденцию: что в группе пациентов с отрицательным результатом преобладали лица старше по возрасту, в анамнезе, получавшие заместительную терапию препаратами тестостерона от 2 до 5 лет, имели избыточную массу тела или ожирение, а также гинекомастию.

Проведенное микроскопическое исследование биопсийного материала яичек у 6 пациентов отделения ВРТ ФГБУ ЭНЦ показало разную гистологическую картину: от тотальной дегенерации извитых семенных канальцев (1—2 балла по Johnsen плюс Сертоли-клеточный синдром и гиалинизация семенных канальцев по McLachlan) (рис. 1, II) до канальцев с сохранным сперматогенезом (9 баллов по Johnsen и гипосперматогенез по McLachlan, когда все этапы сперматогенеза присутствуют, но выражены в той или иной степени даже в единичных семенных канальцах), а также в отдельных канальцах присутствуют только клетки Сертоли (см. рис. 1, IV). Однако на всех препаратах без исключения отмечалась частичная/полная атрофия извитых семенных канальцев (см. рис. 1, I, II, IV), которая проявлялась не только утратой сперматогенного эпителия, но и гиалинизацией канальцев. На месте сперматогенного эпителия извитого семенного канальца можно было видеть либо клеточные тени (см. рис. 1, II, III), либо только клетки Сертоли (см. рис. 1, I). Дистрофия соединительной ткани канальцев выражалась гиалинозом. Гиалиновая масса всегда занимала гораздо больший объем, чем та часть ткани, на месте которой она образовалась (см. рис. 1, V), и представляла собой агрегацию склеропротеинов со сходными физическими и тинкториальными свойствами (гомогенность, аморфность) (табл. 2).

Два пациента в возрасте 28 и 30 лет имели минимальную по продолжительности стимуляцию сперматогенеза и схожую гистологическую картину — сочетание гиалинизации семенных канальцев и остановку развития зародышевых клеток на стадии сперматоцитов 1-го порядка. Остальные мужчины (за исключением пациента с успешным SRR) имели гомогенную картину семенных канальцев, что, по Johnsen, не превышало 2 баллов.

На гистологических препаратах очевиден тестикулярный фиброз (см. рис. 1, I). Данные литературы [19, 21—26] сообщают об увеличении количества тучных клеток у мужчин с тяжелым нарушением сперматогенеза, что часто ассоциируется с перитубулярным фиброзом, поскольку ферменты этих клеток — химаза и трипсин — стимулируют пролиферацию фибробластов и отложение коллагеновых волокон в интерстиции органа. И это было отражено в гистологических результатах наших пациентов, в то время как у мужчин с нормальным сперматогенезом их количество вокруг кровеносных сосудов незначительно. Кроме того, продукты метаболизма тучных клеток оказывают цитотоксическое действие на эндотелиоциты, препятствуя выработки ими ингибитора трипсина.

Первая результативная микро-ТЕSЕ (пациент 15 лет) носила диагностический характер и была проведена с целью получения и замораживания сперматозоидов для реализации в будущем репродуктивной функции; вторая (мужчина 22 лет) — в рамках программы ЭКО—ИКСИ.

Сперматозоиды, пригодные для оплодотворения методом ИКСИ, были получены в день пункции фолликулов и аспирации ооцитов у партнерши. Получено 11 зрелых ооцитов (стадия MII). На следующие сутки верифицировано 10 зигот. Культивирование эмбрионов осуществлялось в мультигазовом инкубаторе при температуре 37 °C; CO₂ — 6%; O₂ — 5%.

Уже после первого и второго дробления эмбрионы имели диффузную фрагментацию и неравную величину бластомеров. На 3-и сутки эмбрионы отставали в развитии и не имели 8-клеточного набора. Степень фрагментации у некоторых эмбрионов достигала 50% объема. Тенденция запаздывания была отмечена и на 4-е сутки развития. У отдельных эмбрионов отмечалось только начало компактизации, а стадия морулы отсутствовала. На 5-е сутки развития четыре эмбриона достигли стадии морулы, у одной из которых началась кавитация. Морулы не имели тотальной компактизации клеток и демонстрировали инвагинации. Был выполнен хэтчинг. Проведение преимплантационной диагностики (ПГД) было отложено на сутки. На 6-е сутки культивирования из четырех морул образовались три: 5ВВ, 5ВВ, 6ВВ (по Гарднеру).

Для исключения риска передачи хромосомных аномалий потомству был проведен забор клеток трофэктодермы бластоцист с использованием лазерной биопсии, которая позволяет уменьшить механическое воздействие на эмбрион и провести процедуру максимально быстро и точно. После биопсии три эмбриона были витрифицированы.

Полученные клетки трофэктодермы были использованы для ПГД методом высокопроизводительного секвенирования следующего поколения (метод NGS, Next Generations Sequencing), результаты которого представлены в табл. 3 и на рис. 2. Результат секвенирования эмбриона № 3 получился неоднозначный. От повторной биопсии пациенты отказались. Таким образом, результаты исследования были приняты в том виде, как рекомендует программное обеспечение BlueFuse компании «Illumina», применяемое для исследования анеуплоидий.

По итогам исследования клеток трофэктодермы, супружеской паре необходима консультация клинического генетика о возможности переноса эмбриона № 2, который остается на сегодняшний день витрифицированным.

В настоящее время не существует единого мнения ни об оптимальном для извлечения сперматозоидов возрасте, ни об оптимальных сроках начала медикаментозной терапии. Введение экзогенного тестостерона может снижать вероятность извлечения сперматозоидов. Не исключено, что это связано с исходно более тяжелой андрогенной недостаточностью у пациентов, которым назначают инъекции тестостерона [27].

Данный эффект может быть связан с тем, что при пиковом повышении уровня тестостерона в крови по механизму обратной связи снижается гипофизарная секреция ФСГ и ЛГ, что и приводит к остановке сперматогенеза. Позднее назначение препаратов тестостерона мужчинам с СК с заместительной целью зачастую усугубляет клиническую картину гипогонадизма. На сегодняшний день эта дилемма до конца не разрешена, так как имеется противоречие между отсутствием репродуктивной задачи у подростка и ухудшением репродуктивного прогноза у зрелого мужчины, которому требуется заместительная андрогенотерапия, ухудшающая SRR. Недавние исследования [28] показали, что использование местных (трансдермальных) андрогенов в сочетании с препаратами ингибиторов ароматазы у юношей в возрасте 14—22 лет с СК за 1—5 лет до хирургического извлечения сперматозоидов не приводит в будущем к снижению SRR.

Предположение, что более старший возраст лиц с СК, отсутствие эффекта от предоперационной терапии и уровень общего тестостерона менее 8,7 нмоль/л являются плохими прогностическими факторами в отношении получения качественных сперматозоидов и частоты наступления клинической беременности, что подтверждается и на нашей когорте мужчин [16].

Различия в частоте получения сперматозоидов могут быть связаны с гетерогенностью морфологии тестикулярной ткани. Наибольшая SRR имела место у пациентов, которые в предоперационном периоде принимали ингибиторы ароматазы, а само извлечение сперматозоидов проводилось методом микро-ТЕSЕ. Длительная заместительная терапия тестостероном у мужчин с СК ассоциировалась с наименьшей SRR [27]. В нашем исследовании мужчины из группы с отрицательным результатом преимущественно получали препараты андрогенов от 2 до 5 лет.

Прекращение введения препаратов тестостерона мужчинам с СК за 6—12 мес до начала лечения бесплодия и назначение в предоперационном периоде препаратов ингибиторов ароматазы минимально в течение 6 мес, чтобы снизить уровень эстрадиола и повысить уровень тестостерона, приводит не только к повышению частоты извлечения, но и улучшению качества тестикулярных сперматозоидов [29].

СК имеет большую распространенность в общей популяции, но своевременно диагностируется редко. На сегодняшний день не определен ни оптимальный возраст для извлечения сперматозоидов, ни оптимальное время назначения заместительной терапии тестостероном. Микрохирургический метод извлечения сперматозоидов (микро-ТЕSЕ), совмещенный с программой ЭКО—ИКСИ, остается пока единственным эффективным методом не только получения сперматозоидов, но и рождения детей у этой когорты мужчин, так как только данный вид хирургического вмешательства позволяет выделять семенные канальцы из фиброзированной ткани яичка. Введение экзогенного тестостерона и нормализация его уровня в сыворотке крови не повышают уровень интратестикулярного тестостерона, что, вероятно, связано с недостаточной васкуляризацией гипоплазированных яичек, а лишь приводит к снижению уровня ФСГ [30].

Пациенты с положительным результатом микро-ТЕSЕ не имели существенных отличий по объему яичек и гормональному статусу от пациентов группы с отрицательным исходом, кроме одного значения — уровня общего тестостерона у мужчины 22 лет с положительным результатом SRR, который на этом этапе работы может служить прогностическим фактором.

Лучшие прогностические факторы в отношении получения сперматозоидов и большие шансы на благоприятный исход лечения бесплодия, по-видимому, имеют мужчины с уровнем общего тестостерона более 8,7 нмоль/л, нормальным ИМТ, отсутствием гинекомастии и отвечающие на предоперационную гормональную терапию.

На всех гистологических препаратах пациентов с СК отмечается частичная или полная атрофия извитых семенных канальцев, которая проявляется утратой сперматогенного эпителия, гиалинизацией канальцев и фиброзом интерстиция.

Увеличение анеуплоидных бластоцист от пациентов с СК может быть связано с повышением доли анеуплоидных сперматозоидов. Мозаицизм бластоцист по аутосомам может быть связан с соматическими мутациями на ранних стадиях дробления и с нерасхождением хромосом во время митоза. Дальнейшее развитие мозаичного эмбриона определяется характером хромосомной аберрации, локализацией гетероплоидных клеток и степенью выраженности аномального клона. Поскольку в некоторых случаях хромосомные ошибки могут быть переданы потомству, этой когорте пациентов необходимо проведение ПГД бластоцист для выявления эуплоидных эмбрионов, подлежащих переносу в полость матки матери.

Включение СК в скрининг заболеваний обязательного генетического обследования новорожденных повысит его выявляемость и улучшит прогнозы реабилитации как соматического, так и репродуктивного здоровья мальчиков. Приведенные современные данные, возможно, позволят разрушить врачебный стереотип о «бесполезности» работы с этой когортой пациентов для преодоления бесплодия. Лечение пациентов с СК, планирующих реализацию репродуктивной функции, необходимо осуществлять в специализированных клиниках, имеющих возможность выполнения сложных программ ВРТ, микро-ТЕSЕ, биопсию эмбрионов, ПГД/NGS.

Мультидисциплинарный подход и дальнейшие клинические исследования должны способствовать оптимизации и стандартизации лечения пациентов с СК.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.