Влияние наночастиц серебра на ооциты и эмбрионы

Наномедицина и нанофармакология развиваются высокими темпами в поиске новых лекарственных средств. Ведущее место среди них занимают препараты на базе наночастиц серебра (НЧС). НЧС с уникальными оптическими, электронными и антибактериальными свойствами уже широко используюся в биосенсорах, фотонике, электронике [1], а также как противомикробные средства [2]. Сегодня широкий спектр антимикробной активности НЧС — основное направление развития продуктов НЧС, включая текстиль, контейнеры для хранения продуктов питания, антисептические спреи, катетеры и повязки. В последнее время начали рассматривать возможность терапевтического применения НЧС в качестве противоопухолевых агентов [3].

Цель работы — сбор, анализ и обобщение данных литературы о влиянии НЧС на окружающую среду и здоровье человека, ооциты и эмбрионы, а также о возможных механизмах действия НЧС.

Методы синтеза. Известны следующие методы синтеза наноструктур серебра — химические, физические и биологические. Химические методы разделяют на: электрохимические методы, химическое восстановление, химические методы с облучением, а также пиролиз [4]. Синтез наноструктур серебра в растворе, как правило, состоит из трех основных компонентов: металлические предшественники, восстановители и стабилизаторы. Широко используются такие восстановительные агенты: боргидрид, цитрат натрия, аскорбиновая кислота, спирт и соединения гидразина. Сообщается, что пламенная аэрозольная технология обеспечивает тщательный контроль содержания и размера НЧС [5].

Физические методы не предполагают токсичных химических веществ и, как правило, не отнимают много времени на изготовление. Такие методы включают: конденсацию из паровой фазы, дуговой разряд, метод энергетического шара, а также метод постоянного тока магнетронного распыления. Преимущество физических методов заключается в том, что НЧС имеют узкое распределение по размеру, а основным недостатком является энергетическая затратность при их изготовлении [6].

Основные физико-химические свойства. Форма наноструктур серебра может значительно повлиять на их физические и химические свойства. Часто используемые серебряные наноструктуры включают серебряные сферические наночастицы, нанопровода, наностержни, нанопластинки и нанокубики. Малые частицы имеют большую площадь поверхности и большую токсичность. Показано, что биологические эффекты НЧС также зависят от различных поверхностных зарядов их покрытий, которые могут влиять на взаимодействие НЧС с живыми системами. Установлено, что агломерация НЧС происходит как в культуральной среде, так и внутри цитоплазмы и в ядрах клеток [7].

Растворение НЧС в результате окисления поверхности приводит к образованию ионного серебра. Скорость растворения зависит от химических и поверхностных свойств частиц, а также их размера, и от окружающей среды [8]. G. Sotiriou и соавт. [9] сообщили о том, что упаковка НЧС в тонкий слой SiO₂ сводит к минимуму их токсичность, блокируя высвобождение ионов.

Влияние НЧС на окружающую среду. В окружающей среде распространение НЧС происходит по разным путям, изменяя их свойства, содержание и токсичность. Согласно S. Blaser и соавт. [10], серебро может высвобождаться из твердых отходов (на свалке твердых отходов), во время термической обработки отходов, в сточные воды или непосредственно путем выгрузки в природные воды. Осадок сточных вод применяется для сельскохозяйственных почв, вывозится на свалки твердых бытовых отходов или сжигается. Захоронение твердых отходов может сопровождаться проникновением серебра в недра и подземные воды. Кроме того, непосредственный выброс в окружающую среду происходит из сточных вод, неочищенных сточных вод, а также из вод, которые подаются для полива на сельскохозяйственные поля. Следы серебра регистрируются в текстильных изделиях и пластмассе [10].

НЧС реагируют с сульфидом, хлоридом и другими природными веществами, изменяя оригинальные свойства наночастиц. C. Levard и соавт. [11] обнаружили, что даже низкая степень сульфидирования НЧС приводит к значительному снижению их токсичности из-за низкой растворимости сульфида серебра.

Таким образом, на сегодня мало известно о конкретных последствиях влияния НЧС на окружающую среду и практически невозможно достоверно оценить экологические риски, связанные с их производством и использованием.

Влияние НЧС на здоровье человека. НЧС могут взаимодействовать при кожном контакте, пероральном введении, ингаляции и при попадании в кровоток. Известно, что размер НЧС диктует свой режим цитотоксичности по отношению к макрофагам мыши. Токсичность НЧС (<10 нм) в основном опосредована влиянием ионов Ag⁺ на печень, как основной орган-мишень, селезенку, легкие и почки [12].

Показано, что введение крысам линии Wistar 20 мг и 100 нм НЧС в дозе 6 мг на 1 кг массы тела привело к увеличению размера селезенки и повреждению печени [13].

Исследование ингаляционной токсичности показало, что НЧС влияют на нейтральные муцины в слизистой дыхательных путей крыс Sprague—Dawley, подвергавшихся их воздействию при концентрациях 0,50—0,61 мкг/м³, но без токсического эффекта [14].

Не установлено никаких существенных отклонений в состоянии здоровья у работников, задействованных в производстве наноматериалов и подвергающихся воздействию серебра. Уровень серебра в пробах крови составил 0,0135—0,0340 мг/м³, в моче — 0,0430 мг/м³ [15].

Таким образом, методы синтеза и различные размеры НЧС определяют их токсикологические свойства. Несмотря на то что проводились токсикологические исследования НЧС, все еще трудно сделать однозначный вывод о степени их влияния на организм человека.

Недавние исследования [16] подтвердили, что наночастицы получают доступ к яичникам, а также проникают через гематотестикулярный и плацентарный барьеры.

Изучали влияние НЧС (сферические, 8 нм) в условиях введения беременным мышам. Результаты показали, что НЧС обладают потенциалом прервать вынашивание плода посредством аномального развития плаценты и эпигенетических изменений в эмбрионе [17].

Изучали действие НЧС (20 нм) на кумулюсные клетки у мышей in vitro. Установлено увеличение митохондриально-опосредованного апоптоза кумулюсных клеток путем высвобождения цитохром С из митохондрий в результате транслокации BAX в митохондрии [18].

Оценивали влияние чистых НЧС, наночастиц золота и частиц сплава на способность ооцита к достижению метафаз I и II мейоза и на кумулюсное расширение кумулюсных клеток [16]. Непосредственно граничащие с ооцитом кумулюсные клетки содержали наночастицы золота в значительно меньшем количестве по сравнению с частицами серебра. Частицы сплава золото-серебро обладают токсичностью по отношению к ооцитам в зависимости от мольной доли содержащегося серебра: для НЧС с содержанием до 50% серебра не выявлено каких-либо существенных эффектов, в то время как НЧС с 80% серебра вызывают почти полное угнетение созревания ооцитов. Независимо от токсичности частицы серебра преимущественно связываются с кумулюсными клетками, а не с ооцитами [16, 19].

Не установлено влияния на ооциты наночастиц сплава, содержащего 50% серебра, в то время как серебро в той же концентрации (3,3 мг/мл), и меньше оказывает угнетающее влияние [20].

С помощью конфокальной микроскопии выявлено выборочное поглощение наночастиц золота ооцитами, в то время как серебро и частицы сплава оседают в основном в слое кумулюсных клеток, окружающих ооцит. Ооциты млекопитающих чувствительны к наночастицам, содержащим серебро, а именно завершение мейоза уязвимо к наносеребру. Результаты предполагают, что высвобожденные ионы Ag⁺ ответственны за токсичность, тогда как сплавы в определенной степени смягчают токсические эффекты [19].

Следует отметить, что существует так называемая общая концепция цитотоксических эффектов с участием наночастиц золота и серебра, которая рассматривает серебро как потенциально более агрессивное, чем золото [21].

Несмотря на то что в последние годы публикуется около 1000 статей в год по нанотоксикологии, только некоторые из них касаются влияния НЧС на сперматозоиды и яйцеклетки [16]. Поэтому актуальными являются исследования, в которых будет проведена оценка влияния НЧС на репродуктивную функцию с использованием самок животных.

Установлено, что повторное пероральное введение НЧС во время беременности не вызывает изменений в развитии эмбриона и плода в условиях введения в дозах до 1000 мг/кг/сут [22]. Также не установлено никакого влияния НЧС на эмбрионы мышей [23]. Тогда как есть данные, что НЧС (50 мкмоль) угнетают развитие преимплантационных эмбрионов мыши in vitro [24].

Темпы развития бластоцист после микроинъекции НЧС на двухклеточной стадии эмбрионов мыши не различаются в опытных и контрольных группах. С использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени при анализе шести онтогенетически важных генов (ВАХ, BCL2L2, TP53, OCT4, NANOG, Dnmt3a) не выявлено влияния наночастиц на экспрессию генов бластоцисты. В отличие от НЧС, введение сопоставимой концентрации ионов Ag⁺ приводило к немедленной задержке развития эмбриона [23]. Есть также данные о том, что НЧС не влияют на развитие преимплантационных эмбрионов до стадии бластоцисты, и не установлено изменений в экспрессии генов-кандидатов для оценки развития эмбриона свиньи [16].

Таким образом, приведенные данные подтверждают, что ооциты и эмбрионы являются чувствительной системой для исследований, связанных с нанотоксикологией, в которой могут быть визуализированы тонкие эффекты. Использование такой тестовой системы в будущем будет способствовать углублению понимания возможных эффектов действия наночастиц на женскую репродукцию.

Есть данные о том, что НЧС влияют на индукцию окислительного повреждения, изменение регуляции ферментов, отвечающих за вывод свободных радикалов, изменение регуляции путей экспрессии генов, участвующих в апоптозе, и нарушение регуляции клеточных структур, участвующих в хранении, детоксикации и метаболизме металлов в различных органах [25].

Установлено, что наночастицы могут непосредственно индуцировать производство активных форм кислорода (АФК), как только они подвергаются воздействию кислой среды лизосом [26].

АФК содержат супероксид-анион (O₂^–), гидроксильные радикалы (^•OH) и перекись водорода (H₂O₂). Реакция между H₂O₂ и НЧС, как полагают, является одним из факторов, приводящих к высвобождению Ag⁺ в условиях in vivo. Кроме того, АФК обладают высокой реакционной способностью и могут привести к окислительному повреждению белков и ДНК и индуцировать дисфункцию митохондрий. НЧС и ионы Ag⁺ также могут выходить из лизосом, далее вызывая увеличение образования внутриклеточных АФК [27]. Также НЧС могут через комплексы ядерных пор диффундировать и переходить в ядро, что приводит к образованию АФК, которые непосредственно вызывают повреждения ДНК и хромосомные аномалии [27].

Для большинства клеток поглощение НЧС происходит в основном за счет эндоцитоза и зависит от дозы, а основными целевыми органелл являются эндосомы и лизосомы. R. Singh и P. Ramarao [28] показали также накопление Ag⁺ в лизосомах. Недавние исследования также показали, что Ag⁺ может непосредственно привести к повреждению ДНК в дополнение к повреждению митохондрий и индуцировать производство АФК [29]. НЧС и высвобожденные ионы Ag⁺ взаимодействуют с тиоловыми группами молекул, присутствующих в цитоплазме, клеточной мембране и внутренней мембране митохондрий, и увеличивают проницаемость как клетки мембран, так и митохондриальных систем [30]. Повреждение клеточных мембран приводит к утечке содержания цитоплазмы и возможному некрозу, в то время как разрыв лизосомальных мембран активизирует опосредованный лизосомами апоптоз. Повреждение митохондрий будет ухудшать перенос электронов, тем самым запуская митохондрийзависимый апоптоз [31].

Несмотря на то что токсичность, как представляется, обусловлена окислением и воспалением [32], все еще не совсем ясно, что именно отвечает за токсические эффекты серебра в форме наночастиц [20] или они исключительно вызваны ионами серебра в ходе окисления металла [33]. Так, ионы серебра оказались такими же токсичными, как и частицы металла, содержащего 80% серебра, и чистые НЧС, указывая на то, что их токсический потенциал сопоставим [19].

Таким образом, все еще не совсем понятно, что именно отвечает за эффекты серебра в форме наночастиц. На сегодня ясно, что возможный механизм, лежащий в основе действия НЧС, включает образование АФК (супероксидных радикалов, гидроксильных радикалов и др.).

Итак, данные литературы позволяют утверждать, что, несмотря на многообещающий потенциал для применения в медицине и на проводимые ранее токсикологические исследования НЧС, все еще трудно сделать однозначный вывод о степени их влияния на организм человека.

На сегодня мало известно о конкретных последствиях влияния НЧС на окружающую среду и практически невозможно достоверно оценить экологические риски, связанные с их производством и использованием.

Все еще не совсем понятно, что именно отвечает за эффекты серебра в форме наночастиц; на сегодня ясно, что возможный механизм, лежащий в основе действия НЧС, включает образование АФК (супероксидных радикалов, гидроксильных радикалов и других).

Данные литературы позволяют утверждать, что ооциты и эмбрионы являются чувствительной системой для исследований, связанных с нанотоксикологией, в которой могут быть визуализированы тонкие эффекты. Использование такой тестовой системы в будущем будет способствовать углублению понимания возможных эффектов действия наночастиц на женскую репродуктивную систему.

Актуальными становятся исследования, в которых будет проведена оценка влияния различных доз, способа, кратности введения НЧС разного размера на репродуктивную функцию с использованием самок животных. Такие исследования предоставят новые данные, которые будут способствовать более полному пониманию механизмов действия НЧС в лабораторных условиях, а также успешному переходу нанотехнологии серебра в клинику.

Работа выполнена в рамках научной программы отдела иммунофизиологии Института физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины: «Исследование молекулярно-генетических и иммунопатологических механизмов функциональных нарушений женской репродуктивной системы и возможности их коррекции», государственный регистрационный номер темы 0112U008233 и целевой комплексной программы фундаментальных исследований НАН Украины «Фундаментальные проблемы наноструктурных систем, наноматериалов, нанотехнологий» по договору № 19-Н.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Сбор и обработа материала — М. Ступчук, О. Блашкив

Концепция, дизайн, написание текста и редактирование — Т. Вознесенская.