В настоящее время не вызывает сомнения, что характер репродуктивных процессов в значительной степени зависит от состояния белкового баланса в организме женщины, особенно в период гестации, когда усиливается интенсивность метаболических процессов, в связи с необходимостью обеспечения потребностей не только матери, но и развивающегося плода. В то же время особенности синтеза белков и их последующих постгеномных изменений при физиологической и осложненной беременности во многом остаются невыясненными. Значительные успехи в этом направлении могут быть достигнуты с использованием современных технологий молекулярной медицины, к числу которых относится протеомный анализ, с помощью которого определяются дифференциально-экспрессирующиеся белки, а также методы оценки посттрансляционных реакций [1, 2]. Информативным объектом изучения данных процессов в биологической системе мать—плод является плацента, обеспечивающая взаимосвязь между ними и снабжающая плод необходимыми для его развития трофическими и другими компонентами. В связи с этим функциональная и метаболическая дисфункция плаценты, связанная с модификацией белоксинтезирующих систем и повреждением нормального спектра и свойств белков, может служить важной причиной высокой перинатальной заболеваемости и смертности при плацентарной недостаточности (ПН).

Цель настоящей работы — выявить и идентифицировать дифференциально-экспрессирующиеся белки, а также изучить посттрансляционные изменения белков плаценты при ПН.

В исследование вошли 28 беременных в возрасте 24—32 лет (средний возраст 27,5 года). Контрольную группу составили 13 практически здоровых женщин с неосложненным течением беременности и родов. Основная группа включала 15 женщин, беременность которых осложнялась ПН, верифицированной после родов. Все обследованные дали информированное согласие на расширенный алгоритм исследования, утвержденный этическим комитетом Ростовского НИИ акушерства и педиатрии. По возрасту, индексу массы тела, соматическому и акушерско-гинекологическому анамнезу, паритету беременности и родов женщины обеих групп были сопоставимы. Из исследования исключались пациентки с инфекционными заболеваниями, декомпенсированными формами соматических заболеваний, многоплодной беременностью, аутоиммунной патологией, признаками преэклампсии. Критериями при постановке диагноза (и для включения в исследование) являлись снижение фето- и маточно-плацентарного кровотока при допплерометрии, биофизический профиль плода, гипоксия плода при проведении кардиотокографии, снижение активности специфических плацентарных изоферментов — термостабильной щелочной фосфатазы и глутаматдегидрогеназы.

Материалом исследования служили плаценты, взятые после родов при соблюдении холодового режима (4 °С). Посттрансляционные изменения белков (амидирование, аминирование, карбонилирование) оценивали по количеству амидных, аминных групп и карбонильных производных водорастворимых белков плаценты, которые экстрагировали из 10% гомогенатов ткани в течение 20 ч при температуре 4 °C и отделяли от нерастворимых белков центрифугированием при 9000 g в течение 30 мин в рефрижераторной центрифуге Sigma Laborzentrifugen (Германия).

Количество амидных групп определяли по уровню аммиака, отщепившегося после 10-минутного и 2-часового гидролиза белков в 1 н. H₂SO₄, с помощью реакции несслеризации [3]. Содержание белковых аминогрупп оценивали по разности между концентрацией общего аминоазота в экстракте белков и остаточного аминоазота в нейтрализованных экстрактах после осаждения белков раствором 20% трихлоруксусной кислоты. Метод основан на взаимодействии аминогрупп с суспензией фосфорнокислой меди и образовании цветного соединения в результате реакции между растворимым медным комплексом и диэтилдитиокарбаматом, интенсивность окраски которого оценивали спектрометрически при 410 нм [4].

О степени карбонилирования белков судили по образованию 2,4-динитрофенилгидразонов в реакции карбонильных производных с 2,4-дифенилгидразином. Оптическую плотность образованных соединений регистрировали спектрометрически при длине волны 363 нм и рассчитывали их величины, используя коэффициент молярной экстинкции, равный 22∙10³ М^–1см^–1 [5]. Содержание белка в пробах определяли по молярной экстинкции при 280 нм.

Для определения интенсивности дифференциальной экспрессии белков проводили протеомный анализ плаценты. Протеомные карты плацентарной ткани получали с помощью двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле (приборы Protein IEF Cell и Protean II xi Multi-Cell («Bio-Rad», США). После завершения электрофореза для визуализации белковых пятен в гелях фореграммы окрашивали азотнокислым серебром, сканировали и анализировали с использованием пакета программ PDQuest («Bio-Rad», США). Идентификацию белков после вырезания пятен из геля и процедуры трипсинолиза проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF-MS) на масс-спектрометре Autoflex II («Bruker», Германия) с использованием программы Mascot MS Search («Matrix Science», Великобритания) и баз данных NCBI и Swiss-Prot.

Статистическую обработку данных протеомного анализа осуществляли с использованием лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0. фирмы «StatSoft. Inc.»). Достоверность различий между сравниваемыми группами для каждого белка определяли с помощью χ²-критерия. Статистическую обработку результатов изучения функциональных групп белков проводили по той же программе, однородность дисперсий проверяли по критерию Фишера. Достоверность различий определяли по критерию Стьюдента (t-критерий) и его аналогу для непараметрических распределений — критерию Манна—Уитни. Результаты оценивали как статистически значимые при p<0,05.

Проведенные исследования выявили значительные посттрансляционные изменения структуры водорастворимых белков плаценты при ПН (табл. 1). Снижается их амидированность: общий уровень амидных групп уменьшается на 30,0% по сравнению с таковым при физиологической беременности. Наряду с изменениями общего количества амидных групп меняется соотношение между легко- и трудногидролизируемыми (прочносвязанными) группами, поскольку содержание последних снижается в большей степени (на 33,2%), чем первых (на 15,2%). Коэффициент отношения легкогидролизируемых амидных групп к трудногидролизируемым увеличивается на 26,9%. Отклонение в содержании амидов разной устойчивости, особенно прочносвязанных, принадлежащих глутамину, свидетельствует о глубокой перестройке белковых молекул, отражающейся на их физико-химических свойствах. Она приводит к перераспределению водородных и электростатических взаимодействий в молекулах белков, в результате чего может понизиться уровень «структурных барьеров», защищающих пептидные связи от протеолитической атаки.

Наряду с модификацией амидированности белков плаценты изменяется и содержание в них аминогрупп. Степень аминированности белков при ПН снижена на 23,5% относительно аналогичной величины у женщин контрольной группы. Уменьшение количества аминогрупп также сопровождается утратой устойчивости белков к действию факторов, нарушающих их структуру.

Противоположная динамика наблюдается для интенсивности карбонилирования. Уровень карбонильных производных, представляющих собой окисленные аминокислотные остатки белков, повышается на 32,0% в плаценте при П.Н. Этот факт свидетельствует о важной роли свободнорадикальной составляющей в постгеномном повреждении структуры белков при ПН, течение которой сопровождается нарастанием внутриутробной гипоксии и кислородной недостаточности плода. Усиление окислительной деструкции белков приводит к нарушению различных уровней белковой структуры, в том числе не только боковых цепей аминокислотных остатков, но и с окислением более глубоких участков белковой молекулы [5]. Выявленная посттрансляционная модификация белков плаценты может отражаться на их протеомном спектре.

Полученные нами результаты подтверждают эту возможность и свидетельствуют об изменении протеомного профиля плаценты при ПН (табл. 2). Следует отметить, что помимо списка дифференциально-экспрессирующихся белков в работе приведена совокупность генов, обеспечивающих экспрессию этих белков (см. табл. 2), которая позволяет составить генетическую карту предрасположенности к нарушению функционально-метаболической полноценности плаценты и к формированию изучаемой патологии гестации.

К числу белков, экспрессия которых практически отсутствует или значительно снижена при осложненной беременности, относятся представители семейства кальций- и фофолипидсвязывающих белков, в частности аннексины А2 и А4, выполняющие важные функции в клеточном метаболизме. Аннексин А2, локализованный как в цитоплазме, так и на плазматической мембране, контролирует связи между ними, тем самым влияя на внутри- и межклеточный транспорт биосубстратов, также известна его роль в формировании цитоскелета, в том числе и апоптозных клеток [6].

Что касается аннексина А4, способного регулировать образование белковых конгломератов на поверхности клетки и модулировать трансмембранный переход белков, то уменьшение его экспрессии нарушает выполнение этих функций [7]. Кроме того, поскольку аннексин А4 способен взаимодействовать с субъединицей p50 транскрипционного фактора NF-κB [8], снижение продукции данного белка изменяет внутриклеточные функции указанного фактора.

При беременности, осложненной ПН, обнаруживается отсутствие таких дифференциально-экспрессирующихся белков, как цитоплазматические актины-1 и -2. Эти изоформы актина в виде микрофиламентов принимают участие в проведении внутриклеточных сигналов и через ряд промежуточных процессов (транспорт мРНК, транскрипция и др.) в конечном счете регулируют экспрессию определенных генов [9]. Модификация экспрессии этих генов, в результате снижения (отсутствия) продукции актинов в свою очередь может явиться одной из причин изменения уровня тех белков, синтез которых обеспечивается репрессированными генами.

Нарушение экспрессии характерно еще для одного белка — α-тропомиозина, который, связываясь с актиновыми филаментами, обеспечивает миграцию клеток, цитокенез, процессы пролиферации. Уменьшение его продукции, очевидно, оказывает отрицательное действие на процессы, находящиеся в сфере влияния данного белка [10].

Изучаемая акушерская патология сопровождается также уменьшением в плаценте содержания эндоплазматического ретикулярного белка — ERp29, являющегося ключевым фактором в фолдинге (сворачивании полипептидной цепи в пространственную структуру) эндогенных секреторных белков. Известно, что снижение его экспрессии приводит к нарушению функции протеасом и изменению степени клеточной пролиферации [11], высокая интенсивность которой характерна для плацентарной ткани.

Сниженная экспрессия регистрируется для прохибитина, являющегося шапероном — белком, участвующим в восстановлении правильной структуры полипептидной цепи белков митохондрий, в которых он регулирует клеточный цикл [12]. Уменьшение продукции этого белка ухудшает функционирование митохондриальных структур плаценты, что сопровождается снижением в них генерации энергии и, как следствие, развитием внутриклеточной гипоксии, а в дальнейшем — окислительного стресса.

Как указывалось выше, снижение содержания некоторых дифференциально-экспрессирующихся белков ухудшает процессы транскрипции, одновременно при ПН нарушаются и процессы трансляции. Последнему способствует снижение экспрессии кислого рибосомального белка 60S [13]. Изменение процессов трансляции, очевидно, вносит существенный вклад в развитие выявленных нами посттрансляционных модификаций белков плаценты при ПН. В то же время, по принципу обратной связи, последние отражаются на спектре плацентарных белков.

Негативное действие на состояние метаболических процессов в ткани плаценты оказывает повышение продукции α-актинина-4, который участвует в передаче клеточных сигналов из цитоплазмы в ядро, способствуя увеличению экспрессии генов, усиливающих апоптоз [9]. Повышенно экспрессируются при ПН белки цитоскелета — виментин, β-тропомиозин и белок эндоплазматического ретикулума — эндоплазмин. Увеличение их продукции может иметь компенсаторное значение, поскольку первые два принимают участие в формировании клеточной структуры и функционировании цитоскелета [11, 14], а эндоплазмин, как молекулярный шаперон, играет важную роль в эндоплазматическом ретикулуме при ядерной сигнализации и секреции ряда регуляторных белков [15]. Очевидно, что такая направленность динамики этих белков способствует предотвращению развития декомпенсированной ПН и донашиванию патологической беременности. Однако усиление экспрессии вышеперечисленных протеинов не компенсирует отрицательные последствия подавления продукции большого количества мультифункциональных белков, что создает условия для развития ПН и перинатальных осложнений.

В ранее проведенных нами исследованиях протеомный дисбаланс установлен и в околоплодных водах, что предполагает системный характер модификации экспрессии белков при ПН [16].

Таким образом, результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что при ПН происходят значительные отклонения в экспрессии белков плаценты и посттрансляционные изменения, охватывающие различные уровни белковой структуры. Данные изменения, с учетом того факта, что они происходят на геномной и постгеномной стадиях, могут служить первичными звеньями в цепи нарушений метаболизма плаценты и фетоплацентарного комплекса в целом при ПН.

Конфликт интересов отсутствует.