Профилактика репродуктивных потерь занимает важное место в современном акушерстве и перинатологии. Поэтому вопросы совершенствования методов прогнозирования и диагностики патологии беременности требуют новых подходов с использованием технологий молекулярной биологии и медицины. Поскольку перинатальный период развития связан с глубокими молекулярно-клеточными преобразованиями не только в организмах матери и плода, но и в плаценте, осуществляющей тесную взаимосвязь между ними, изучение последней может дать чрезвычайно ценную информацию о механизмах развития акушерской, пре- и постнатальной патологии.

Метаболические процессы в плаценте во многом зависят от состояния ее белкового компонента. Изменение структуры и физико-химических свойств белков, выполняющих многочисленные регуляторные, а также пластические, структурные и транспортные функции, возможно, является одним из пусковых звеньев формирования плацентарной недостаточности (ПН), сопровождающей многие осложнения беременности и приводящей к нарушению развития плода, а впоследствии и новорожденного. Важным показателем конформационных изменений белков является модификация их спектральных характеристик [1, 2]. К числу последних относится величина поглощения ионизированных участков пептидной цепи в ультрафиолетовой (УФ) области [3].

Цель настоящей работы — изучение УФ-спектров и коэффициента ионизации боковых групп водорастворимых белков (КИБГ) в плаценте при физиологической беременности и ПН.

В исследование включены 59 беременных в возрасте 23—30 лет (средний возраст 25,2±0,4 года), разделенные на три группы. В 1-ю группу вошли 20 женщин с ПН, доносивших беременность (38—40 нед), во 2-ю группу — 17 женщин с ПН, у которых беременность закончилась преждевременными родами в 34—37 нед. Диагноз П.Н. был верифицирован после родов по данным микроскопических исследований последа; в 3-ю (контрольная) группу вошли 22 женщины, беременность которых протекала без осложнений и закончилась родами в срок.

Критериями при постановке диагноза (и для включения в исследование) служили снижение фето- и маточно-плацентарного кровотока при допплерометрии, отставание роста плода, по данным ультразвуковой биометрии, снижение уровня специфических плацентарных изоферментов (глутаматдегидрогеназы и термостабильной щелочной фосфатазы), обнаружение признаков гипоксии плода при проведении кардиотокографии и по содержанию ксантина и гуанина в крови [4]. По возрасту, индексу массы тела, числу беременностей и родов, соматическому и акушерско-гинекологическому анамнезу обследуемые группы беременных были сопоставимы. Критериями исключения из исследования явились декомпенсированные формы соматических заболеваний, многоплодная беременность, антенатальная гибель плода, аутоиммунная патология. Все женщины дали информированное согласие на участие в исследовании в рамках программы «Акушерский мониторинг», реализуемой в ФГБУ «РНИИАП».

Материалом исследования служили плаценты, взятые сразу после родов при соблюдении холодового режима (4 °С). Навески плацентарной ткани гомогенизировали на холоде с дистиллированной водой (1:10). Гомогенаты оставляли на 18—20 ч при 4 °C для экстракции водорастворимых белков. Нерастворимые белки отделяли центрифугированием при 9000 g в течение 30 мин (рефрижераторная центрифуга «Sigma Laborzentrifugen», Германия). Водорастворимую фракцию белков очищали от низкомолекулярных компонентов путем гель-фильтрации через сефадекс G-25 и снимали абсорбционные спектры в УФ-области при 245—285 нм на спектрофотометре СФ-104 (НПО «Аквилон», Санкт-Петербург). Результаты выражали в виде спектральных величин зависимости оптической плотности (ОП) от длины волны. В исследуемых пробах определяли содержание белка по молярной экстинкции при 280 нм.

Для характеристики модификаций физико-химических свойств исследуемых белков использовали также КИБГ, который характеризует способность некоторых функциональных групп переходить в ионизированное состояние при изменении pH среды [5, 6]. Последнее сопровождается сдвигами максимумов и интенсивности абсорбции в УФ [7]. Для оценки величины КИБГ снимали УФ-спектры в диапазоне 260—320 нм в двух буферных системах: фосфатном буфере pH 7,0 и боратном pH 12,0. Максимум отношения ОП при длине волны 300—305 нм соответствует изменению поглощения ионизированных фенольных гидроксилов тирозина и является показателем конформационных изменений белков [8].

Выбор тирозина для изучения УФ-спектров белков обусловлен тем, что среди ароматических аминокислот, способных к поглощению в УФ-области, именно эта аминокислота вносит оптимальный вклад в данное поглощение за счет интенсивного электронного перехода в ближней УФ-области (выше 230 нм) и большего количества в водорастворимых белках по сравнению с триптофаном и фенилаланином [9, 10]. Следует подчеркнуть, что информативность абсорбции в УФ для суждения о модификации белковых молекул связана с практическим отсутствием поглощения протеиногенными кислотами в области видимого спектра.

При анализе полученных результатов учитывали интенсивность абсорбции в области максимума и изменение спектральных кривых, о котором судили по отношению величин ОП при 260 и 280 нм. С целью исключения влияния количественных изменений белков перед снятием УФ-спектров проводили предварительное уравнивание концентрации белка в пробах.

Содержание остатков тирозина и фенилаланина в водорастворимых белках плаценты после гидролиза их аликвотной части в 6 н. растворе HCl определяли на автоматическом анализаторе AAA-4000 («Microtechna», Чехия). Подготовку ткани и анализ проводили согласно инструкции к анализатору по стандартной программе для гидролизатов белков.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0. фирмы «StatSoft Inc.»). Результаты оценивали как статистически значимые при p<0,05. Корреляционный анализ выполнен методом Спирмена с расчетом коэффициента ранговой корреляции (r).

Полученные данные свидетельствуют о том, что УФ-спектры водорастворимых белков плаценты при неосложненной беременности имеют максимум абсорбции в области 275 нм (табл. 1). Некоторый сдвиг максимума в коротковолновую область может объясняться наличием комплексов с другими соединениями, в частности, с нуклеиновыми кислотами и нуклеотидами, имеющими максимум поглощения при 260 нм.

Развитие ПН происходит на фоне изменения УФ-спектров белков плаценты по сравнению с таковыми при физиологической беременности (см. рисунок). В 1-й группе женщин обнаруживается повышение ОП в области максимума абсорбции на 24% и снижение интенсивности поглощения в области 260 нм на 12%, что приводит к модификации формы спектральных кривых, которая находит свое отражение в изменении отношения ОП при 260 и 280 нм. Этот показатель при доношенной беременности, протекавшей на фоне ПН, снижается на 28% (с 0,88±0,045 до 0,64±0,025). Снижение данного отношения, по-видимому, является результатом диссоциации комплексов водорастворимых белков с нуклеиновыми кислотами и нуклеотидами. Присутствие большого количества нуклеопротеинов в спектре плацентарных белков при нормальной беременности и их уменьшение при ПН показаны нами ранее [11].

Для проверки возможности связывания нуклеотидов, выходящих при гель-хроматографии совместно с белками в свободном объеме колонки с сефадексом G-25, водорастворимые белки обрабатывали в течение 10 мин при 0 °C 0,2 н. раствором HClO₄. Выпавшие в осадок белки отделяли центрифугированием, а полученную надосадочную фракцию использовали для снятия УФ-спектров в области 245—285 нм. УФ-спектры данной фракции имели максимум поглощения при 260 нм. Причем эти соединения, дающие полосу абсорбции в УФ-спектре, не являлись продуктами гидролиза нуклеиновых кислот, поскольку для последнего необходим продолжительный контакт с более концентрированной хлорной кислотой.

Дальнейшее исследование УФ-спектров фракции низкомолекулярных нуклеотидов, связанных с белками плаценты, подтвердило, что вышеотмеченные модификации спектров в определенной мере обусловлены также уменьшением уровня этих компонентов (табл. 2). Интенсивность абсорбции в области максимума спектра нуклеотидов (260 нм) снижается при ПН у женщин 1-й группы на 20% по сравнению с показателями в контрольной группе. Важно отметить, что уменьшение количества связанных нуклеотидов сопровождается соответствующим изменением в плаценте при ПН содержания их свободных форм [12].

Что касается белковых молекул, то поскольку концентрация белка в пробах предварительно уравнивалась, модификация их УФ-спектров в отличие от спектров нуклеотидов не связана с количественным фактором и определяется структурными изменениями. Подтверждением этого служат результаты исследования КИБГ водорастворимых белков. Величина КИБГ белков при 305 нм в плаценте женщин 1-й группы составляет 2,96±0,17, что на 27% (p<0,01) превышает аналогичный показатель в контрольной группе (2,33±0,12).

Повышение КИБГ белков, очевидно, обусловлено снижением участия тирозильных радикалов во внутри- и межмолекулярных взаимодействиях в связи с частичной дезинтеграцией белковых ассоциатов, следствием чего является увеличение количества ионизированных гидроксильных групп. Перераспределение спектра межмолекулярных связей может также наступить в результате изменения содержания функциональных групп белков в условиях недостаточности плаценты. Так, обнаруженное нами увеличение амидированности водорастворимых белков [13] отражается на доступности карбоксильных групп для образования водородных связей с гидроксилами тирозина. Аналогичное действие может оказывать и изменение степени связывания с белками, а именно с остатками ароматических аминокислот, ионов некоторых металлов, в частности цинка, который находится в составе домена «цинковые пальцы» в ряде регуляторных белков [14]. Показано, что при ПН имеет место перераспределение между свободным и связанным пулом цинка [15].

На характер УФ-спектров и величину КИБГ, по-видимому, влияет и изменение аминокислотного спектра белков. При беременности, осложненной ПН, но завершившейся родами в срок, происходит снижение количества белковосвязанных ароматических аминокислот, поглощающих в УФ-области: тирозина и фенилаланина — на 25 и 19% соответственно (p<0,01). Если в плацентах женщин контрольной группы их содержание составляет 4,36±0,23 и 3,85±0,18 моль%, то в 1-й группе — 3,27±0,19 и 3,12±0,15 моль%. Динамика этих полярных аминокислот нарушает соотношение между ними и гидрофобными аминокислотами, что также способно вызвать изменение характера межмолекулярных взаимодействий.

Проведенный корреляционный анализ выявил прямую взаимосвязь между КИБГ и содержанием тирозина в водорастворимых белках плаценты (r=0,75), для фенилаланина степень корреляции менее значима (r=0,59). Возможно, что одной из причин изменения КИБГ белков является различная активность плацентарных пептид-гидролаз при физиологической и осложненной гестации. При П.Н. интенсивность процессов протеолитической деструкции белков значительно возрастает, и это вряд ли остается без существенных последствий для их структуры [4], в том числе для процесса ионизации освободившихся при протеолизе функциональных групп.

При преждевременных родах у женщин 2-й группы изменения УФ-спектров и КИБГ белков плаценты имеют направленность, аналогичную таковым в 1-й группе. ОП в области максимума повышается на 33% по сравнению с нормальными показателями (см. табл. 1). Величина КИБГ плацентарных белков при преждевременных родах (3,07±0,19) увеличивается на 32% (p<0,01) относительно соответствующего показателя в контрольной группе.

В то же время в отличие от УФ-спектров, характерных для плацентарных белков женщин контрольной и 1-й групп, в данной группе наблюдается сдвиг максимума в область более длинных волн (280 нм), что, очевидно, связано со снижением уровня нуклеопротеиновых фракций и связанных нуклеотидов в составе водорастворимых белков при недонашивании беременности. Последнее подтверждается особенностями УФ-спектра фракции связанных нуклеотидов после кислотного гидролиза белков (см. табл. 2). Отношение О.П. при 260 и 280 нм, отражающее модификацию формы спектральных кривых, снижается по сравнению с нормальной величиной на 34%.

Степень повышения КИБГ, как и уменьшения отношения ОП при 260 и 280 нм, свидетельствует о том, что у женщин 2-й группы преждевременному прерыванию беременности предшествуют более глубокие структурные повреждения белков плаценты, чем при донашивании беременности, осложненной ПН.

Резюмируя полученные данные, можно заключить, что формирование ПН происходит на фоне модификации структуры белков плаценты, сопровождающейся диссоциацией сложных протеиновых комплексов, необходимых для выполнения многочисленных функций белков. Выявленные изменения, несомненно, вносят существенный негативный вклад в развитие метаболических нарушений в фетоплацентарной системе при ПН.

Конфликт интересов отсутствует.