Работы последних лет осуществили значительный прорыв в сфере изучения естественных процессов старения женских гонад и позволили сформировать представление об индивидуальных «биологических часах» [1]. Критически важной для сохранения «репродуктивного потенциала женщины» является физиологическая цикличность работы гипоталамо-гипофизарно-яичниковой оси, которая легко дезориентируется под воздействием стрессорных факторов [2]. В наши дни не только урбанистический стресс, но и ятрогенные факторы влияют на овариальную функцию. Современные женщины все чаще подвергаются оперативному вмешательству. Частота гистерэктомии в структуре гинекологических операций является чрезвычайно высокой в репродуктивном возрасте не только у нас в стране [3, 4]. Операция снижает овариальный резерв и приближает наступление менопаузы [5, 6]. Профилактическое удаление маточных труб только усугубляет ситуацию [7]. Молекулярные основы патофизиологии овариальной недостаточности после операции не изучены.

В течение более полувека было известно, что фолликулогенез регулируется гормонами гипофиза [8], однако только в последнее десятилетие стало очевидным, что гонадотропное действие на яичник опосредуется сигналами внутри гонады (паракриновая регуляция) и путем прямой межклеточной связи через щелевые каналы [9]. Взаимодействие ооцита и фолликулоцитов управляет ростом и дифференцировкой фолликулов, координируя пути развития обоих типов клеток [10]. Наиболее изученными факторами компетентности развития фолликулов являются костный морфогенетический протеин (BMP)15, коннексин (Cx)37 и антимюллеров гормон (AMГ) [9, 11—13].

Цель исследования— изучить экспрессию BMP15, Cx37 и AMГ в фолликулярном эпителии и ооцитах после удаления матки и маточных труб в эксперименте.

Эксперимент выполнен на половозрелых крысах-самках массой 200 г, аутбредный сток Wistar. Животным основной группы (n=30) проводили лапаротомию, удаление маточных рогов и яйцеводов. Контроль — ложнооперированные крысы (n=12). Для анестезии использовали Zoletil-50 («Virbac Sante Animale», Франция) из расчета 100 мкг на 1 кг массы тела. Операции осуществлялись с помощью аппарата С-350 Р.Ч. Электропульс (Томск, регистрационный номер: 42/99−1038−1411; сертификат соответствия №РОСС RU. ME41.B02148) с использованием биполярного зажима с браншами 1 мм при мощности 2—4 Вт. Животных выводили из эксперимента декапитацией на 2, 10 и 30-е сутки опыта в соответствии с «Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (ETS № 123)» (Страсбург, Франция, 1986), принципами Хельсинкской декларации (9-й пересмотр, Форталеза, Бразилия, 2013). После забора яичники фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин. Иммуногистохимическое исследование экспрессии BMP15, Cx37, AMГ проводили методом высокотемпературной демаскировки антигена с использованием стрептавидин-биотиновой системы детекции Abcam PLC (Великобритания) Rabbit Specific HRP/DAB (ABC) Detection IHC Kit. Использованы поликлональные первичные антитела BiorbytLTD (Великобритания): BMP15 (orb100551), Cx37 (orb6190), AMГ (orb101542). Результат идентифицировали по коричневому цитоплазматическому/мембранному окрашиванию. Полуколичественную оценку проводили согласно R. McClelland и соавт. (1991) по формуле H-score = (1×% слабопозитивных клеток) + (2×% умеренно позитивных клеток) + (3×% сильно позитивных клеток). По сумме баллов оценивали результат: 0—50 — экспрессии нет, 51—100 — слабая, 101—200 — умеренная, ≥201 — сильная экспрессия.

Методы статистики. Анализ результатов проводили с использованием программы IBM SPSS Statistics v.23.0 5. Проведены разведочный анализ проверки формы распределения (критерий Шапиро—Уилка) и оценки гомогенности дисперсий в сравниваемых группах (критерий Левена). Учитывая данные представленных выше критериев, проводился H-тест Краскела—Уоллиса, апостериорные сравнения U-критерием Манна—Уитни с критическим уровнем значимости p=0,017.

При изучении химических процессов в гонадах дифференцированы изучаемые молекулярно-биологические маркеры взаимодействия ооцита и клеток окружения (BMP15, Cx37), фактор пролиферативной активности гранулезы (AMГ). Экспрессия изучаемых молекул после оперативного лечения оказывалась типичной. Только применение полуколичественной методики H-score позволило оценить степень экспрессии биомаркеров и ее динамику у животных сравниваемых групп.

BMP15. Экспрессия сигнальной молекулы была выявлена в ооцитах и клетках кумулюса яичников крыс. Фактор роста был обнаружен также в клетках теки, интерстициальной ткани, лютеоцитах желтого тела и покровном эпителии. Интенсивность экспрессии была наибольшей в ооцитах примордиальных (ПФ) и первичных фолликулах (ПРФ), наименьшей — в ооцитах вторичных (ВРФ) и третичных фолликулов (ТРФ). Выраженное иммунопозитивное окрашивание выявлялось в ооцитах фолликулов с начальными признаками атрезии, где половая клетка сохранна. Экспрессия маркера в фолликулярном эпителии в целом оказывалась более низкой, интенсивность увеличивалась по мере роста и развития фолликулов. Удаление маточных рогов и яйцеводов приводило к увеличению интенсивности иммуноокраски ооцитов ПФ и ПРФ, максимально выраженной на 10-е сутки опыта. При этом экспрессия маркера в ооцитах ВРФ и ТРФ оставалась неизмененной, умеренной к окончанию эксперимента. В атретических фолликулах (АФ) любого типа и размера без признаков гипертрофии фолликулярных оболочек ооциты оказывались окрашенными менее интенсивно, чем в контроле. Окраска клеток кумулюса и париетальных фолликулоцитов в эксперименте незначительно повышалась только в ранние сроки опыта (2-е сутки) в ПФ и фолликулах, только вступивших в рост, оставаясь неизмененной в более крупных фолликулах. К 10-м суткам опыта экспрессия BMP15 снижалась после операции вне зависимости от типа фолликулов, а к 30-м суткам соответствовала таковой в контроле.

H-тест показал значимые изменения экспрессии BMP15 при сравнении с контролем в ооцитах: ПФ (H₍₃₎=55,5; p<0,001), ПРФ (H₍₃₎=54,0; p<0,001), ВРФ (H₍₃₎=42,2; p<0,001), ТРФ (H₍₃₎=64,1; p<0,001), АФ (H₍₃₎=21,7; p<0,001) и фолликулярном эпителии всех типов фолликулов: ПФ (H₍₃₎=15,7; p=0,001), ПРФ (H₍₃₎=14,1; p=0,003), ВРФ (H₍₃₎=13,3; p=0,004), ТРФ (H₍₃₎=8,7; p=0,034), АФ (H₍₃₎=28,6; p<0,001). Сравнительный статистический post hoc анализ экспрессии маркера представлен на рис. 1. Обращало на себя внимание повышение экспрессии BMP15 после операции в ооцитах всех типов растущих фолликулов в ранние сроки (2—10-е сутки), ПФ (10-е сутки), которое сохранялось к окончанию эксперимента (30-е сутки) только в фолликулах начальных этапов развития. Повышение экспрессии маркера установлено в фолликулярных эпителиоцитах ПРФ на 2-е сутки. На 10-е сутки показано снижение иммунной окраски в фолликулярном эпителии всех типов РФ и АФ (значимое для ПФ, ВРФ и АФ). На 30-е сутки опыта экспрессия BMP15 в фолликулоцитах не отличалась от таковой в контроле.

Cx37. Экспрессия щелевого контакта была выявлена в ооцитах, фолликулярных эпителиоцитах, отдельных лютеоцитах и эндотелиоцитах сосудов яичников крыс. В каждой стадии развития фолликулов ооциты характеризовались более интенсивной окраской, чем фолликулярный эпителий. Слабое и умеренное иммунопозитивное окрашивание наблюдалось на поверхности ооцитов (мембранное) ПФ и границе с прегранулезными клетками. Иммунопозитивная реакция волнообразно нарастала по мере роста и развития фолликулов, достигала максимума в конце преантральной стадии. Позитивное окрашивание включало ооциты, zona pellucida, висцеральные фолликулоциты и клетки кумулюса. В фолликулярном эпителии динамика иммунной окраски была аналогичной. Антральные и преовуляторные фолликулы (ВРФ и ТРФ) характеризовались диффузной, неравномерной иммунолокализацией маркера в фолликулоцитах, менее интенсивной окраской ооцитов. При наличии атрезии слабое и умеренное иммунное окрашивание определялось в клетках гранулезы. Экспрессия Cx37 оказывалась выраженной в АФ с гипертрофией теки, в начальных этапах атрезии в ооцитах при его сохранности.

H-тест показал значимую динамику экспрессии Cx37 в течение 30 сут опыта при сравнении с контролем в ооцитах: ПФ (H₍₃₎=10,8; p=0,013), ВРФ (H₍₃₎=50,3; p<0,001), ТРФ (H₍₃₎=27,3; p<0,001) и фолликулярном эпителии: ПФ (H₍₃₎=12,9; p=0,005), ПРФ (H₍₃₎=24,3; p<0,001), АФ (H₍₃₎=14,6; p=0,002). В ооцитах ПРФ (H₍₃₎=4,6; p=0,205) и АФ (H₍₃₎=4,6; p=0,205), фолликулярном эпителии ВРФ (H₍₃₎=1,3; p=0,720) и ТРФ (H₍₃₎=5,3; p=0,148) динамики не установлено. Сравнительный статистический post hoc анализ экспрессии маркера представлен на рис. 2. После удаления маточных рогов и яйцеводов динамика иммунной окраски ооцитов оказывалась волнообразной, аналогичной контролю со смещением в сторону антральных фолликулов в ранние сроки опыта. Максимальная экспрессия Cx37 установлена в ооцитах ВРФ и ТРФ на 2-е сутки эксперимента. В фолликулярном эпителии ПРФ иммунная реакция оказывалась слабее контроля. От 10-х до 30-х суток опыта экспрессия маркера в ооцитах не отличалась от таковой в контрольной группе, однако эффект операции, проявляющийся снижением окраски в фолликулоцитах, сохранялся вплоть до окончания эксперимента.

AMГ. Экспрессия была выявлена в фолликулярном эпителии всех типов фолликулов, лютеоцитах яичников крыс. ПФ характеризовались слабым окрашиванием фолликулоцитов, редко — выраженной экспрессией. В большинстве ПФ интенсивность иммунных сигналов в фолликулярном эпителии была умеренной. По мере увеличения количества слоев фолликулоцитов в ПФ экспрессия AMГ в клетках гранулезы возрастала, сохраняясь также в антральных (ВРФ) фолликулах. По мере увеличения полости в фолликуле интенсивность окраски резко снижалась. АФ характеризовались неравномерной экспрессией маркера в париетальных фолликулоцитах.

H-тест показал значимые изменения экспрессии AMГ при сравнении с контролем в фолликулярном эпителии: ПРФ (H₍₃₎=28,6; p<0,001), ВРФ (H₍₃₎=16,3; p=0,001), АФ (H₍₃₎=21,4; p<0,001). В фолликулоцитах ПФ (H₍₃₎=3,9; p=0,278) и ТРФ (H₍₃₎=6,2; p=0,103) динамики не установлено. Сравнительный статистический post hoc анализ экспрессии маркера представлен на рис. 3. После удаления маточных рогов и яйцеводов динамика иммунной окраски фолликулоцитов оказывалась смещенной в сторону преантральных фолликулов, аналогично контролю. Во все сроки опыта экспрессия AMГ в фолликулярном эпителии всех типов фолликулов оказывалась сниженной: на 2-е сутки значимо в ПРФ, на 10-е — во всех РФ и АФ, на 30-е — только в ВРФ.

H-тест показал значимую динамику экспрессии AMГ в течение 30 сут опыта при сравнении с контролем в фолликулярном эпителии: ПРФ (H₍₃₎=28,6; p<0,001), ВРФ (H₍₃₎=16,3; p=0,001), АФ (H₍₃₎=21,4; p<0,001). В фолликулоцитах ПФ (H₍₃₎=3,9; p=0,278) и ТРФ (H₍₃₎=6,2; p=0,103) динамики не установлено. Сравнительный статистический post hoc анализ экспрессии маркера представлен на рис. 3. После удаления маточных рогов и яйцеводов динамика иммунной окраски фолликулоцитов оказывалась смещенной в сторону преантральных фолликулов, аналогично контролю. Во все сроки опыта экспрессия AMГ в фолликулярном эпителии всех типов фолликулов была сниженной: на 2-е сутки в ПРФ, на 10-е — во всех РФ и АФ, на 30-е — только в ВРФ.

Молекулярные механизмы вторичной овариальной недостаточности после гистерэктомии с маточными трубами не изучены.

Проведенное исследование впервые установило изменения сигнальных маркеров компетентности фолликулярного развития после радикальной операции на матке. В ранние сроки после операции (2-е сутки) в ооцитах показано повышение экспрессии BMP15 во всех типах растущих фолликулов и Cx37 в фолликулах начиная с антральной стадии (вторичные и третичные). Фолликулярный эпителий предполостных (первичных) фолликулов характеризуется увеличением иммунных сигналов для BMP15, снижением — для AMГ и Cx37. Экспрессия BMP15 достигает максимума в ооцитах растущих фолликулов к 10-м суткам опыта, появляется в примордиальных, значительно снижается в атретических, где половая клетка сохранна. Фолликулоциты практически всех типов фолликулов демонстрируют снижение иммунной окраски BMP15 и AMГ. На 30-е сутки эксперимента значимые изменения сохраняются в ооцитах первичных фолликулов (высокая экспрессия BMP15) и фолликулярном эпителии вторичных фолликулов (низкая экспрессия AMГ).

BMP15 представляет собой белок, относящийся к суперсемейству трансформирующих факторов роста β. Сигнальная молекула является мощным митогеном для гранулезных клеток, продвигает процесс роста и созревания фолликулов с гонадотропиннезависимой стадии фолликулогенеза [13]. Подтверждающим фактом является обнаружение максимальной экспрессии фактора в преантральных фолликулах в проведенном исследовании, что согласуется с данными литературы [14]. Повышение экспрессии маркера в ооцитах растущих фолликулов после оперативного лечения в ранние сроки может носить компенсаторный характер. В исследованиях, проведенных ранее, показано, что удаление матки и маточных труб может приводить к вторичной недостаточности яичников [15]. Вероятным механизмом является ишемия гонад [16]. Высокая экспрессия BMP15 направлена на предотвращение апоптоза гранулезных клеток в условиях недостатка кровообращения, морфологически проявляется инициацией фолликулярного роста, увеличением всех форм растущих фолликулов в ответ на повреждающее действие операции [15].

Cx37 представляет собой трансмембранный белок ключевой коммуникационной системы фолликула, приводимый в действие гранулезными клетками для возобновления мейоза первичным ооцитом. Увеличение экспрессии щелевого контакта в ооцитах фолликулов поздних этапов развития на 2-е сутки после удаления маточных рогов и яйцеводов предполагает высокое качество фолликулогенеза — полноценный рост до преовуляторной стадии. Снижение экспрессии сигнального протеина в фолликулярном эпителии первичных фолликулов не столь существенно, так как не является необходимым условием достижения мейотической компетентности ооцита [11].

AMГ — белок, экспрессирующийся в фолликулярных эпителиоцитах, ограничивает формирование пула первичных фолликулов и препятствует чрезмерной фолликулярной ФСГ вербовке, предотвращая преждевременное истощение фолликулов/ооцитов [17, 18]. Снижение экспрессии маркера в фолликулярном эпителии в ранние сроки после операции свидетельствует об инициации примордиальных фолликулов, снятии блока ФСГ-индуцированного роста преантральных фолликулов.

На 10-е сутки опыта экспрессия BMP15 в ооцитах всех типов растущих фолликулов достигает максимума по сравнению с контролем и предыдущей точкой опыта (данные сравнений не представлены). В условиях избыточного вступления фолликулов в рост (максимальное снижение экспрессии AMГ в фолликулоцитах растущих фолликулов) компетентность фолликулогенеза необходима уже со стадии примордиальных фолликулов (появление значимо более высокой экспрессии BMP15 в ооцитах). Следует отметить, что взаимодействие между ооцитами и фолликулярными эпителиоцитами антральных и преовуляторных фолликулов через щелевые контакты уже соответствует таковому в контроле (см. рис. 2).

На 30-е сутки эксперимента пролиферативная активность гранулезы по значениям экспрессии AMГ в преантральных фолликулах соответствует таковой в контроле, может предполагать завершенность фолликулогенеза. В подтверждение этому сохраняется относительно более высокая экспрессия BMP15 в первичных фолликулах. Однако предыдущие работы [15] показали преждевременную лютеинизацию растущих фолликулов, истощение фолликулярного пула, исходом которых являлась хроническая ановуляция и фиброзная атрофия яичников к указанному сроку опыта. Следовательно, некомпетентность фолликуло- и оогенеза может быть установлена на завершающих этапах фолликулярного роста. По данным литературы [9, 19], ВМР15 и Cx37 рассматриваются как протекторы гранулезных клеток не только от апоптоза, но и преждевременной лютеинизации. В проведенном исследовании экспрессия BMP15 и Cx37 в ооцитах вторичных и третичных фолликулов значимо не отличается от таковой в контроле, но прогрессивно снижается по сравнению с предыдущими точками опыта (см. рис. 1 и 2).

Инициация фолликулярного роста (снижение экспрессии AMГ в фолликулярном эпителии растущих фолликулов), высокая активность процессов фолликуло- и оогенеза (повышение экспрессии BMP15 и Cx37 в ооцитах растущих фолликулов) в ранние сроки после удаления матки и маточных труб предшествуют овариальной недостаточности. К окончанию эксперимента нарушение функции яичников проявляется неполноценностью заключительных этапов фолликулярного развития (относительное снижение экспрессии BMP15 и Cx37 в ооцитах вторичных и третичных фолликулов).

Конфликт интересов отсутствует.