Инфекционно-воспалительные процессы различных отделов урогенитального тракта мужчины могут являться одной из причин нарушения фертильности и развития патоспермии и, как следствие, быть причиной бесплодных браков, представляющих серьезную медико-социальную проблему [1].

Возможными патофизиологическими механизмами развития бесплодия, связанными с инфекцией мужской репродуктивной системы, являются: прямое влияние на фертильные свойства спермы через уменьшение количества сперматозоидов, угнетение их подвижности, изменение морфологии сперматозоидов и оплодотворяющей способности; непрямое влияние через угнетение сперматогенеза, вызванное повреждением тестикул, аутоиммунными процессами, индуцированными воспалением, секреторной дисфункцией мужских дополнительных половых желез, связанной с инфекцией органов репродуктивного тракта, лейкоцитоспермией со вторичным влиянием на параметры эякулята и т. п. [2, 3].

Одной из причин нарушения фертильности как у мужчин, так и у женщин может быть хламидийная инфекция, передаваемая половым путем, возбудителем которой является Chlamydia trachomatis. Частота встречаемости C. trachomatis в сперме бесплодных мужчин составляет 1,02-1,6% (по фертильным мужчинам данные отсутствуют) [3].

Есть сведения, что C. trachomatis непосредственно повреждает гаметы и таким образом приводит к бесплодию, независимо от повреждений репродуктивного эпителия [4].

Механизмы патогенного действия C. trachomatis до конца не ясны, однако есть сведения о способности хламидий к модуляции суицидной программы клеток хозяина - апоптоза [2, 5, 6].

Апоптоз - особый вид гибели клетки, является фундаментальным процессом регулирования сперматогенеза и имеет характерное сочетание как морфологических, так и биохимических признаков, одним из которых считают изменение в клеточной мембране сперматозоидов. Апоптоз характеризуется определенным набором биохимических маркеров апоптоза, увеличение экспрессии которых коррелирует с фертильностью [7-9].

К ранним изменениям, происходящим в клетке, подвергшейся апоптозу, относится нарушение фосфолипидной асимметрии цитоплазматической мембраны и перемещение фосфатидилсерина (ФС) на ее внешнюю сторону [10-12].

В литературе [2, 13] встречаются противоречивые мнения относительно анти- и проапоптотической активности хламидий. Предполагают, что факторы патогенности C. trachomatis могут играть некоторую роль в осуществлении апоптоза.

К факторам патогенности C. trachomatis, влияющим на физиологию репродуктивных процессов у мужчин и приводящим к бесплодию, относятся липополисахариды (ЛПС) - структурные компоненты бактериальной клетки. ЛПС C. trachomatis являются мощными эндотоксинами, способными оказывать цитотоксическое действие на половые клетки, угнетать их функции и вызывать гибель, снижать частоту оплодотворений и нарушать развитие эмбрионов in vitro [2, 14].

Обсуждение микробиологических аспектов патогенеза мужского бесплодия и изучение апоптогенного действия факторов патогенности C. trachomatis представляются достаточно актуальным и важным в свете поиска новых подходов к лечению и профилактике хронических инфекций, а также открывают перспективы в разработке методических подходов для ранней диагностики и терапии патоспермии.

Цель исследования - оценка патогенного действия ЛПС C. trachomatis, заключающегося в способности вызывать структурно-биохимические изменения в мембране сперматозоидов, индуцируя апоптоз в условиях in vitrо.

В исследовании использовали эякуляты 12 здоровых фертильных мужчин в возрасте от 22 до 40 лет, давших информативное согласие на проведение исследований. Сбор эякулятов проводился после 72 ч сексуального воздержания.

Измерение показателей стандартной спермограммы (концентрация, подвижность, жизнеспособность и морфология сперматозоидов) проводили согласно нормативам ВОЗ [15]. Результаты лабораторных исследований (бакпосев, прямая иммунофлюоресценция) на наличие инфекций половых органов были отрицательными. Жизнеспособность клеток составила около 80%.

ЛПС выделяли из лиофилизированных клеток (элементарных телец) C. trachomatis (серовар Е) («Способ выделения липополисахарида Chlamydia trachomatis». Приоритетная справка № 2015 113658 (021384) от 13.04.15) и проводили 6-часовую инкубацию сперматозоидов с 0,1 мкг/мл ЛПС (опыт).

Контрольные образцы сперматозоидов инкубировали в течение того же времени в среде Menezo B-2 («BioMerieux», Франция) с 5% СО₂ при 37 °C, без добавлений ЛПС.

В качестве положительного контроля для индукции некроза образцы спермы подвергались воздействию высокой температуры 56 °C в течение 1 ч. В качестве положительного контроля для индукции апоптоза проводили 6-часовую инкубацию сперматозоидов с 1 ммоль/л стауроспорина («Sigma», Великобритания).

Для выявления перемещения ФС на внешнюю сторону мембраны сперматозоидов применяли окрашивание клеток конъюгатом аннексина-V с флюорохромом (AnV-FITC) и йодида пропидием (PI) («Boehringer Mannheim», Германия), согласно инструкции изготовителя, используя флюоресцентную микроскопию.

Сразу после инкубации исследовали критерии качества сперматозоидов и подсчитывали количество живых неокрашенных (AnV–/PI–)-сперматозоидов, живых сперматозоидов с признаками раннего апоптоза (AnV+/PI–) и нежизнеспособных мертвых клеток (AnV+/PI+) - и (AnV–/PI+)-сперматозоидов [16, 17].

Данные представлены в виде М±m. Статистическую значимость различий сравниваемых величин оценивали с помощью t-критерия Стьюдента при р<0,05.

Результаты эксперимента выявили, что после 6 ч инкубации в среде без добавлений ЛПС (контроль) подвижность сперматозоидов, количество живых неокрашенных (AnV–/PI–)-сперматозоидов, мертвых (AnV+/PI+) - и (AnV–/PI+)-клеток, а также (AnV+/PI–)-сперматозоидов с признаками раннего апоптоза не изменялось статистически значимо по сравнению со свежевыделенными сперматозоидами (р>0,05).

Контрольные результаты 6-часовой инкубации сперматозоидов были следующими: 68,0±2,0% (AnV–/PI–)-сперматозоидов; 9,4±0,7% (AnV+/PI–)-сперматозоидов; 6,4±1,5% (AnV+/PI+) - и 16,3±1,1% (AnV–/PI+)-сперматозоидов.

После воздействия высокой температуры статистически достоверно увеличивалось (до 66,2±1,7%) количество мертвых сперматозоидов в основном (AnV–/PI+)-клеток по сравнению с контролем (р<0,001), количество (AnV+/PI–)-клеток увеличивалось (до 12,3±1,5%) статистически недостоверно по сравнению с контролем (р>0,05).

Стауроспорин в концентрации 1 ммоль/л вызывал выраженный апоптотический эффект, так как наблюдалось увеличение количества (AnV+/PI–)-клеток до 46,7±2,9% по сравнению с контролем (р<0,001). Однако происходило и увеличение содержания мертвых клеток, но это касалось только (AnV+/PI+)-клеток, так как их количество (12,1±1,1%) было выше, чем в контроле (р<0,01). Увеличение количества (AnV-/PI+)-клеток (до 18,9±3%) после воздействия стауроспорина было статистически недостоверно по сравнению с контролем (р>0,05), но степень увеличения была меньше, чем после воздействия на сперматозоиды высокой температуры (р<0,001).

После 6-часовой инкубации с ЛПС C. trachomatis (серовар Е) наблюдалось снижение подвижности и увеличение (до 27,5±2,4%) содержания (AnV+/PI–)-сперматозоидов по сравнению с контролем (р<0,001). Однако индуцирующее действие ЛПС проявлялось слабее по сравнению со стауроспорином (р<0,001). Уменьшение подвижности половых клеток после воздействия ЛПС C. trachomatis было связано с увеличением доли мертвых сперматозоидов (AnV+/PI+) - и (AnV–/PI+)-клеток, однако это увеличение было статистически недостоверно по сравнению с контролем (р>0,05). Количество мертвых спермиев после воздействия бактериального токсина было меньше, чем после воздействия высокой температуры.

Благодаря исследованиям последних лет стало очевидным, что контроль клеточной гибели хламидиями является одним из главных механизмов их ухода от атаки защитных факторов макроорганизма. Известно, что при инфекционных процессах апоптоз - это протективная реакция организма, направленная на предотвращение распространения инфекции [6, 18].

Хламидии являются теми патогенами, которые обладают эффективными механизмами регуляции апоптоза. На разных этапах своего жизненного цикла хламидии реализуют различную тактику: подавляют апоптоз на первых этапах для того, чтобы обеспечить внутриклеточное размножение, и активируют апоптоз на этапе выхода инфекционных элементарных телец и дальнейшего распространения инфекции.

Токсичные продукты, типа ЛПС, выделяемые хламидиями, могут играть некоторую роль в осуществлении апоптоза [2, 14].

В настоящем исследовании выявлено различие в содержании (AnV+/PI–)-сперматозоидов в контроле и в опыте после 6-часовой инкубации с ЛПС C. trachomatis. Этот факт позволяет сделать вывод о том, что действие ЛПС C. trachomatis (серовар E) на сперматозоиды человека in vitro заключается в способности вызывать структурно-биохимические изменения в мембране сперматозоидов, индуцируя апоптоз, ранним признаком которого является нарушение фосфолипидной асимметрии мембраны клетки и перемещение ФС на внешнюю сторону цитоплазматической мембраны сперматозоидов.

Наличие у C. trachomatis механизмов и способности к регуляции апоптоза клеток хозяина реализуется посредством действия ее структурных компонентов - ЛПС - токсичных эндотоксинов, влияющих на фертильность сперматозоидов и способных привести к развитию мужского бесплодия.

Однако можно предположить, что процесс апоптоза сперматозоидов запускается для предотвращения передачи генетических дефектов, так как инфицирование C. trachomatis может повлиять на нормальное развитие эмбрионов, если оплодотворение было успешным.

Таким образом, изучение ЛПС C. trachomatis и их способности индуцировать апоптоз половых клеток открывает перспективы в разработке методических подходов для ранней диагностики как мужского, так и женского бесплодия, а также этиотропной и патогенетической терапии. Изучение таких бактериальных факторов представляется принципиально важным в свете поиска новых подходов к лечению и профилактике хронических инфекций.

Однако для подтверждения данных проведенного эксперимента, полученных в условиях in vitro, необходимы дальнейшие исследования у инфицированных C. trachomatis мужчин, у которых хламидиоз приводит к ухудшению качества спермы.

Конфликт интересов отсутствует.

Источник финансирования - личные средства.