К настоящему времени сформулированы основные и дополнительные признаки, отличающие опухолевую клетку от клетки нормальной ткани, однако эти характеристики изменяются и дополняются в результате значительного прогресса, достигнутого в последние годы в области экспериментальной онкологии, молекулярной генетики и биохимии [1—3]. Одним из наиболее выдающихся открытий в биологии последнего десятилетия следует считать обнаружение системного уровня регуляции активности генов с помощью малых некодирующих молекул — микроРНК [4]. Подавление экспрессии генов с участием микроРНК считают важным механизмом, вовлеченным в большинство внутриклеточных сигнальных путей у многих эукариот. Нарушение этого механизма обнаружено при различных патологиях, в том числе и при развитии опухоли [4].
МикроРНК представляют собой небольшие молекулы, транскрибируются с геномной ДНК, подвергаются процессингу и экспорту в цитоплазму. Они могут входить в состав транскриптов, кодирующих белки, либо транскрибироваться с белок-некодирующих участков. Первый процессинг происходит с участием специализированного ферментного комплекса либо в ходе стандартного сплайсинга мРНК. После экспорта в цитоплазму промежуточный продукт подвергается окончательному процессингу с образованием активного РНК-белкового комплекса, способного связываться с комплементарными участками мРНК-«мишеней». Результатом такого связывания является подавление трансляции с данной мРНК. Сама мРНК может быть расщеплена за счет РНКазной активности комплекса. Известно, что в геноме человека закодировано несколько тысяч микроРНК, образующих обширную регуляторную сеть, которая задействована в самых разных сигнальных путях и клеточных процессах.
МикроРНК активно изучают при онкологических заболеваниях в качестве перспективных маркеров и потенциальных терапевтических агентов. Кроме того, предполагают использовать микроРНК в диагностике и определении прогноза онкологический заболеваний [5—7]. Пристальный интерес к исследованию микроРНК проявляют онкогинекологи, особенно у больных раком яичников (РЯ), поскольку эти опухоли отличаются крайне агрессивным клиническим течением, неблагоприятным прогнозом и вторичной химиорезистентностью, что приводит в быстрой гибели больных.
К злокачественным опухолям яичников относят неэпителиальные опухоли и собственно РЯ, происходящий из клеток эпителия. Патогенез заболевания сложен, многообразен и до конца не изучен. К основным факторам риска развития РЯ относят пожилой возраст, позднюю первую беременность или отсутствие беременностей, короткий срок лактации. Известно, что 5—10% от общего числа случаев РЯ является наследственным. Выделяют три формы семейного РЯ: 1) РЯ; 2) сочетание РЯ и рака молочной железы; 3) сочетание РЯ и колоректального рака (синдром Линча). Наследственная форма РЯ в том числе обусловлена мутациями в генах BRCA1 и BRCA2. Прогноз при неэпителиальных злокачественных опухолях яичников в целом более благоприятный, чем при эпителиальных. Морфологически эпителиальные злокачественные опухоли яичников разделяют на: серозные, муцинозные, эндометриоидные, светлоклеточные, плоскоклеточные, переходно-клеточные, смешанные эпителиальные и недифференцированную карциному. Наиболее неблагоприятным РЯ считают его светлоклеточный тип. При распространенном процессе прогноз РЯ в большей степени определяет TNM-стадия заболевания.
В 2002 г. G. Calin и соавт. [8] впервые опубликовали данные о вовлеченности микроРНК в канцерогенез. За последующие 13 лет различными научными группами выполнено множество исследований, посвященных роли микроРНК в злокачественной трансформации клетки. Показана ассоциация специфических профилей экспрессии микроРНК с TNM стадией заболевания, гистологическим типом опухоли, молекулярно-генетическими событиями в клетках опухоли, ответом на терапию.
Первое исследование изменения уровня экспресии микроРНК при РЯ выполнено в 2007 г. в лаборатории C. Croce [9] на 15 образцах нормальной ткани яичников и 69 образцах РЯ, из них: серозный (31), эндометриоидный (8), светлоклеточный (4), муцинозный (1), гистологические типы и 9 недифференцированных карцином. Показано, что наиболее значимо увеличивается уровень экспрессии микроРНК-200а, -141, К-200c и -200b и снижается уровень микроРНК-199A, -140, микроРНК-145 и -125b1. На основании предложенного профиля экспрессии микроРНК авторам удалось не только дифференцировать образцы РЯ от нормальных тканей яичников, но и выделить некоторые гистологические его подтипы. Так, микроРНК-21, микроРНК-203 и микроРНК-205 были сверхэкспрессированы только в образцах опухолей эндометриоидного гистотипа РЯ. E. Nam и соавт. [10] также обнаружили высокую экспрессию онкогенной микроРНК-21 в 85% и значительное снижение экспрессии микроРНК-125b в 95% образцов РЯ.
L. Zhang и соавт. [11] в исследовании образцов опухолей на ранних и поздних стадиях РЯ показали связь значительного снижения экспрессии микроРНК-15а, -34а и -34b с опухольсупрессорной функцией. Ген микроРНК-15а оказался делетирован в 23,9% образцов РЯ. R. Eitan и соавт. [12] аналогично наблюдали снижение уровня микроРНК-34а, а также уровня микроРНК-200а и -449b по мере прогрессии заболевания от I к III стадии.
В настоящее время по данным различных исследовательских групп более 50 микроРНК, определяемых в плазме крови, являются онкомирами в отношении РЯ (табл. 1).
Роль членов семейства микроРНК-200 (-141, -200а, -200b, -200c, -429) в патогенезе РЯ неоднозначна. С одной стороны, известно, что микроРНК-200 ингибируют эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП), т. е. выступают онкосупрессорами; с другой стороны, опубликованы данные о том, что высокий уровень микроРНК-200 ассоциирован с неблагоприятным прогнозом заболевания.
Мишенями микроРНК-200 являются репрессоры транскрипции Е-кадхерина Zeb-1, Zeb-2. E-кадхерин вовлечeн в механизмы регуляции межклеточной адгезии, клеточной подвижности и пролиферации эпителиальных клеток. Подавление экспрессии Е-кадхерина является необходимым условием ЭМП. Известно, что ЭМП представляет собой процесс утраты клетками опухоли эпителиального фенотипа в пользу мезенхимального, характеризующегося синтезом N-кадхерина, виментина, фибробластспецифического протеина-1, матриксных металлопротеиназ. ЭМП является центральным событием в механизмах метастазирования [20].
C. Pecot и соавт. [20] показали, что микроРНК-200 также ингибируют ангиогенез, снижая экспрессию цитокинов интерлейкина-8 и CXCL1. На различных экспериментальных моделях авторы убедительно продемонстрировали торможение ангиогенеза и регрессию опухоли в целом при введении синтетических микроРНК-200 [21]. Помимо микроРНК-200 в негативной регуляции ангиогенеза участвуют микроРНК-145, -125b, -199a и -27а.
МикроРНК-181а, напротив, активирует ЭМП ингибированием Smad7 — негативного регулятора индуктора ЭМП — трансформирующего фактора роста β. МикроРНК-9 также активирует ЭМП, непосредственно ингибируя экспрессию Е-кадхерина [22].
МикроРНК-31, -214 и -155 вовлечены в регуляцию формирования опухоль-ассоциированных фибробластов — компонента опухолевого микроокружения, обеспечивающего ее прогрессию [23].
BRCA ½ являются генами-супрессорами опухолевого роста, кодируют белки системы репарации двуцепочечных разрывов ДНК. Носительство мутаций в генах BRCA ½ ассоциировано с высоким риском развития злокачественных опухолей яичников. Тем не менее у таких пациенток прогноз в целом благоприятнее, чем при носительстве генов дикого типа, что объясняется лучшим ответом на терапию препаратами платины, нарушающими структуру ДНК. Однако известно, что в некоторых случаях пациентки с диким типом генов BRCA ½ также могут демонстрировать хороший ответ на терапию препаратами платины. Y. Gu и соавт. [24] предположили, что в этом случае уровень белков BRCA ½ снижается за счет негативного регулирования некоторыми микроРНК. В исследовании авторы обнаружили три кандидатные микроРНК: -146а, -148а и -545, показавшие ассоциацию с благоприятным течением заболевания (общая выживаемость и отсутствие рецидивов) у пациенток с диким типом генов BRCA ½.
Биологическая и клиническая роль некоторых микроРНК в патогенезе злокачественных опухолей яичников представлена в табл. 2.
Прогностическая роль микроРНК оценивают в проспективных исследованиях. В табл. 3 приведены данные 9 исследований, в которых показана ассоциация окномиров с течением и исходом РЯ, главным образом с показателем общей выживаемости и временем выявления рецидива от начала лечения.
Недостаточный уровень белков системы биосинтеза микроРНК в клетках опухолей ассоциирован с неблагоприятным прогнозом. A. Faggad и соавт. [59] в своем исследовании, выполненном на 87 образцах серозного РЯ, обнаружили значительное снижение уровня белка Dicer — ключевого компонента биосинтеза микроРНК. Уровень Dicer обратно коррелировал со стадией заболевания и оказался значительно ассоциирован с общей выживаемостью пациенток. Авторы сделали предположение о глобальном вкладе снижения уровня Dicer в механизмы снижения экспрессии микроРНК в раковых клетках [59]. W. Merritt и соавт. [60] наблюдали снижение экспрессии РНК Dicer и Drosha в клетках РЯ на 60 и 51% соответственно. Низкий уровень экспрессии Dicer и Drosha оказался ассоциирован с поздней стадией заболевания и общей выживаемостью. Медиана выживаемости пациенток с низким уровнем Dicer составила 2,33 года, тогда как с высоким — 9,25 года, с низким уровнем Drosha — 2,74 года, с высоким — 7,92 года соответственно. При одновременной недостаточной экспрессии Dicer и Drosha медиана выживаемости составила 2,66 года, а при высоком их уровне — 11 лет [60].
Исследования роли микроРНК в формировании химиорезистентности РЯ основаны на сравнении уровня микроРНК в клетках нечувствительных и чувствительных опухолей или клеточных линий, выявлении дифференциально экспрессирующихся микроРНК и их мишеней. Ввиду широкой гетерогенности молекулярно-генетических особенностей опухолевых клеток внутри одного гистологического типа (статуса иммуногистохимических маркеров) и двойственной роли отдельных микроРНК в канцерогенезе исследователи получают большое число потенциально значимых микроРНК и, в том числе, противоречивые результаты.
Так, в исследовании A. Sorrentino и соавт. [61] проанализирован уровень экспрессии 381 микроРНК на клеточных линиях РЯ, чувствительных и устойчивых к паклитакселу и цисплатину. Выявлены дифференциально экспрессирующиеся микроРНК: let-7, -30с, -125b, -130а и микроРНК-335. Авторы предполагают, что снижение уровня микроРНК-30с, микроРНК-130а и микроРНК-335, обнаруженное в обеих устойчивых линиях, вносит наибольший вклад в формирование лекарственной резистентности [61].
Одной из мишеней микроРНК-130а является колониестимулирующий фактор макрофагов (М-КСФ). Известно, что М-КСФ стимулирует пролиферацию, дифференцировку и выживание моноцитов, макрофагов и клеток-предшественников костного мозга; продуцируется эпителиальными, стромальными клетками, макрофагами в норме и эпителиальными злокачественными опухолями. Показано, что 75% первичных РЯ и 69% метастазов РЯ продуцируют М-КСФ на уровне, значительно превышающим норму, в связи с чем М-КСФ считают потенциальным маркером, который может быть включен в общую панель маркеров (CA-125II, CA 15—13, CA 72—74), используемых в клинике для диагностики РЯ [16]. Высокий уровень экспрессии М-КСФ и его рецептора ассоциирован с агрессивным течением заболевания и неблагоприятным прогнозом в целом. М-КСФ активирует урокиназный активатор плазминогена, выполняющий, вероятно, ключевую роль в инвазии и метастазировании клеток, так как он превращает плазминоген в плазмин. Плазмин способен непосредственно разрушать некоторые белки внеклеточного матрикса, а также активировать другие металлопротеазы [62]. Роль микроРНК-130а в формировании химиорезистентности в публикации A. Sorrentino и соавт. [61] мало описана. X. Zhang и соавт. [63] также показали снижение уровня микроРНК-130а в цисплатинрезистентной культуре клеток РЯ. В своей работе авторы сфокусировались на иной мишени микроРНК-130а — Х-связанных ингибиторах апоптоза, важнейших регуляторах цисплатин-индуцированного апоптоза [63].
Опубликованы данные о том, что ЭМП раковых клеток помимо метастазирования ассоциирован с формированием химиорезистентности. Высокий уровень микроРНК семейств -200, -let-7 и микроРНК-141, ингибирующих ЭМП, характерен для эпителиального фенотипа клеток опухоли. Более того, микроРНК-200, вероятно, увеличивает чувствительность клеток к препаратам, действующим на микротрубочки (паклитаксел, винкристин, эпотилон В), ингибируя β-тубулин III. Тем не менее опубликованы данные о том, что высокий уровень микроРНК семейства -200 также ассоциирован с неблагоприятным прогнозом РЯ [40]. Позже, в 2013 г. S. Prislei и соавт. [64] в своей работе показали, что высокий уровень экспрессии микроРНК-200 коррелирует с благоприятным или неблагоприятным прогнозом в зависимости от клеточной локализации РНК-связывающего белка HuR, стабилизирующего мРНК, содержащие AU-богатые элементы. МикроРНК-200 способна усиливать ассоциацию мРНК β-тубулина III с HuR и, таким образом, ее трансляцию. В случае если белок HuR локализован преимущественно в цитоплазме, микроРНК-200 стимулирует синтез β-тубулина III и опосредует агрессивное течение заболевания [64].
В 2009 г. в работе T. Boren и соавт. [65] опубликованы результаты исследования уровня экспрессии 335 микроРНК в клетках 16 линий рецидивирующего РЯ, нечувствительных к одному или нескольким препаратам стандартной химиотерапии: цисплатину, доксорубицину, топотекану, паклитакселу, доцетакселу и гемцитабину. 27 микроРНК оказались ассоциированными с резистентностью к терапии, в том числе 7 микроРНК одновременно к двум препаратам: микроРНК-213, -181а и -181b к доксорубицину и гемцитабину, -99b и -514 — к доцетакселу и паклитакселу, -518с — к докситакселу и топотекану, -520f — к доксорубицину и цисплатину. Для 52 генов из предполагаемых авторами мишеней асcоциированных микроРНК в источниках литературы описана роль в формировании химиорезистентности [65].
R. Eitan и соавт. [12] исследовали уровень дифференциально экспрессирующихся микроРНК в образцах опухолей РЯ III стадии, чувствительных и резистентных к препаратам платины. Значимым для формирования химиорезистентности, по мнению авторов, является следующий уровень экспрессии микроРНК: высокий уровень микроРНК-23а, -27а, -30с, -let-7g, -199a-3p и низкий уровень -378 и -625 [12].
Роль микроРНК семейства –let-7 в формировании химиорезистентности не однозначна: описано как снижение, так и увеличение уровня экспрессии –let-7 в раковых клетках, нечувствительных к препаратам одной группы.
В 2008 г. N. Yang и соавт. [66] показали, что рост уровня экспрессии -let-7i увеличивает резистентность раковых клеток к препаратам платины. В 2011 г. L. Lu и соавт. [67] в проспективном исследовании, напротив, показали, что при высоком уровне -let-7а пациентки хорошо отвечали на монотерапию препаратами платины, а при низком — на терапию препаратами платины в сочетании с паклитакселом.
Низкий уровень экспрессии микроРНК-let-7 ассоциирован с резистентностью к препаратам, тропным к микротрубочкам. В основе механизма лежит ингибирование микроРНК-let-7 гена белка IMP-1, стабилизирующего некоторые мРНК. В случае коэкспрессии IMP-1 стабилизирует мРНК белка множественной лекарственной устойчивости 1 (MDR1, multi-drug resistance 1) [68].
В табл. 4 приведены результаты изучения разными группами исследователей экспрессии микроРНК на клеточных линиях РЯ и в образцах опухолей яичников, показавшие ассоциацию с формированием химиорезистентности клеток Р.Я. Однако для использования этих данных в клинической практике необходимы более глубокие исследования.
РЯ, как и любой вид злокачественных опухолей, характеризуется глубокими генетическими и эпигенетическими нарушениями уровня экспрессии микроРНК. Гетерогенность опухолей и сложная интеграция микроРНК в сети регуляции генов осложняет выявление ключевых микроРНК, перспективных для диагностики, оценки прогноза и создания таргетных препаратов. Тем не менее достигнутые результаты вдохновляют исследователей, и, несомненно, биологическая и клиническая роль микроРНК в патогенезе РЯ будет установлена.