В любой клетке организма, в том числе и в половой, заложена генетически обусловленная программа самоликвидации на случай возникновения патологической мутации в клетке или для избавления организма от ненужных или выполнивших свою функцию клеток. Этот физиологический процесс программируемой гибели клеток называется апоптоз, и ему принадлежит важная роль в мужской репродуктивной системе [1—4], в частности в регуляции сперматогенеза [5].

Среди маркеров апоптоза наиболее изученным является клеточный рецептор Fas (СD95), по которому судят о готовности клеток к Fas-индуцированному апоптозу, и его лиганд FasL (СD154), основной индуктор сигнала к запуску апоптоза [6—8]. Fas и FasL — поверхностные белки мембраны клеток, ключевые молекулы запуска процесса апоптоза. Однако следует подчеркнуть, что экспрессия Fas на клетках свидетельствует лишь о потенциальной готовности клетки к Fas-зависимому апоптозу, но ни в коей мере не является доказательством апоптоза [9].

Функции Fas-рецепторно-лигандной системы заключаются в регуляции численности половых клеток на уровне сперматогенеза, а также в отслеживании разнообразных повреждений и сбоев в процессе сперматогенеза и обеспечении удаления поврежденных клеток [1, 10].

Fas-рецепторно-лигандная система вовлечена в защиту от иммунологических реакций в иммунологически привилегированных тканях, в том числе в яичках [6, 11]. Одной из возможных функций FasL, обсуждаемой в последнее время, является функция самозащиты мужской гаметы от антиспермальных активированных лимфоцитов как в мужском, так и в женском половом тракте. Таким образом, экспрессия FasL на сперматозоидах может быть одним из факторов, повышающим их выживание [6, 12, 13].

В литературе встречаются довольно противоречивые данные о наличии на поверхности сперматозоидов маркеров апоптоза Fas и FasL. Так, одни исследователи обнаруживают экспрессию Fas и FasL на сперматозоидах фертильных и субфертильных мужчин, а другие — нет. Это может быть связано с различными методами определения маркеров, а также с качеством реагентов (например, применением разных антител для обнаружения Fas и FasL). Некоторые исследователи считают, что при различных нарушениях сперматогенеза наблюдается изменение экспрессии маркеров апоптоза Fas и FasL на сперматозоидах, отражая активность патологических процессов, протекающих в мужской репродуктивной системе [6, 12, 14—16].

Таким образом, к настоящему времени в мировой литературе не сложилось единого мнения исследователей относительно экспрессии Fas и FasL на половых клетках и в репродуктивной системе мужчин в целом, что диктует необходимость расширения работы в этом направлении.

Кроме того, немногие исследователи пытались выявить корреляцию между экспрессией Fas и FasL на сперматозоидах и некоторыми функционально-морфологическими параметрами (морфология сперматозоидов, концентрация, подвижность) эякулятов мужчин, рекомендованными к исследованию ВОЗ [14, 15].

Цель настоящего исследования — попытка выявить на поверхности сперматозоидов экспрессию Fas и FasL в эякулятах фертильных и субфертильных мужчин и обнаружить взаимосвязь экспрессии этих маркеров апоптоза и традиционных параметров спермы.

Образцы эякулятов 46 здоровых фертильных доноров и 78 субфертильных мужчин (средний возраст 33,5±0,7 года) были собраны мастурбацией в стерильные пластмассовые стаканчики. Сбор эякулятов производился после 72 ч сексуального воздержания. В течение 30 мин при комнатной температуре (22 °C) эякуляты были оставлены для разжижения, после чего каждый образец разделялся на две части: один для анализа функциональных и цитологических параметров, другой для выявления на поверхности сперматозоидов экспрессии Fas и FasL.

Измерение показателей стандартной спермограммы (концентрации, подвижности, жизнеспособности и морфологии сперматозоидов) проводили согласно рекомендациям и нормативам ВОЗ [17, 18].

Для выявления маркеров апоптоза сперматозоиды отделяли от семенной плазмы путем центрифугирования, с последующей процедурой отмывания и ресуспендирования клеток, используя фосфатно-солевой буфер рН 7,4.

Определение экспрессии Fas и FasL включало традиционную подготовку препаратов сперматозоидов, фиксированных на стекле с помощью полилизина, и обработку сперматозоидов соответствующими моноклональными антителами с последующей флюоресцентной микроскопией. Для обнаружения Fas использовали меченные фикоэритрином (РЕ) моноклональные антитела CD95 (CD95-РЕ, IgG1, Caltag Lbs.), согласно инструкции производителя. Для обнаружения FasL использовали биотин-конъюгированные мышиные моноклональные антитела IgG1 к FasL человека (clone NOK-1 Pharmingen; BD, «San Jose», США). Для визуализации реакции антиген—антитело использовали стрептавидин-фикоэритриновую (РЕ) тест-систему (Sav-PE, BD), согласно инструкции производителя.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием программы Statistica 7.0. О достоверности различий показателей в сравниваемых группах судили по величине t-критерия Стьюдента после проверки распределения на нормальность. Статистически достоверными считали различия, соответствующие оценке ошибки вероятности р≤0,05. Оценка взаимосвязи исследуемых показателей осуществлялась подсчетом коэффициента корреляции (r) Пирсона.

При анализе результатов оценки экспрессии мембранных белков Fas и FasL у фертильных мужчин были выявлены три вида сперматозоидов: сперматозоиды, экспрессирующие на поверхности Fas; сперматозоиды, экспрессирующие на поверхности FasL; сперматозоиды, не экспрессирующие таких маркеров апоптоза.

В ходе исследований установили, что у 41 (89%) из 46 мужчин с нормальными параметрами спермы (более 20·10⁶ сперматозоидов в 1 мл; более 50% подвижных; более 14% с нормальной морфологией по «строгим критериям» Kruger—Menkveld [19]) менее 10% сперматозоидов были Fas-положительными. При этом у 11% фертильных мужчин экспрессия Fas-антигена на сперматозоидах не обнаружена. У 9 (20%) фертильных мужчин на сперматозоидах экспрессирован FasL.

Анализируя результаты оценки экспрессии мембранных белков Fas и FasL у субфертильных мужчин, были выявлены следующие виды клеток: сперматозоиды, экспрессирующие на поверхности Fas; сперматозоиды, не экспрессирующие таких маркеров апоптоза.

У 41 (53%) из 78 субфертильных мужчин более 10% сперматозоидов оказались Fas-положительными. При этом у 47% субфертильных мужчин Fas-антиген на сперматозоидах не экспрессирован. Экспрессии FasL на сперматозоидах субфертильных мужчин обнаружено не было.

Анализ корреляции между процентным содержанием сперматозоидов, экспрессирующих Fas, в эякулятах субфертильных мужчин, и традиционными параметрами спермы дал следующие результаты: не обнаружено статистически достоверной корреляции с такими физико-химическими показателями эякулята, как его объем, вязкость и время разжижения.

В качестве морфофункциональных характеристик качества спермы были выбраны двигательные и морфологические параметры, а также концентрация сперматозоидов в эякуляте. Выявлена достоверная отрицательная корреляция между количеством сперматозоидов, экспрессирующих Fas (Fas+), и концентрацией сперматозоидов (r=–0,46; p<0,001); подвижность сперматозоидов положительно коррелировала с содержанием в эякуляте Fas+ клеток (r=0,31; p<0,05); отмечена положительная корреляция количества Fas+ клеток и содержания в эякуляте патологических форм сперматозоидов (r=0,4; p<0,01).

Обобщив данные об экспрессии ключевых молекул запуска апоптоза — Fas и FasL на сперматозоидах фертильных и субфертильных мужчин, можно прийти к заключению о том, что экспрессия Fas-антигена на сперматозоидах у фертильных мужчин наблюдается почти в 90% случаев, в то время как у субфертильных мужчин Fas-антиген экспрессирован лишь у половины обследованных пациентов (53%). Причем у фертильных мужчин, на сперматозоидах которых была выявлена экспрессия Fas-антигена, количество Fas+ клеток составило менее 10%, а у субфертильных мужчин количество Fas+ сперматозоидов в эякуляте превышало 10%.

Экспрессию FasL удалось выявить лишь на сперматозоидах фертильных мужчин и только в 20% случаев. Этот факт, возможно, может объясняться тем, что при подготовке спермы к исследованию в течение 30 мин при комнатной температуре происходил процесс разжижения спермы и за этот промежуток времени FasL мог быть переведен в его растворимую форму sFasL с помощью активированной специфической металлопротеиназы — матрилизина [12, 20].

Однако разжижение — процесс, в норме происходящий и в женском половом тракте. Поэтому, если рассматривать функцию FasL как функцию самозащиты мужской гаметы от антиспермальных активированных лимфоцитов в женском половом тракте, то частичная экспрессия FasL на сперматозоидах у мужчин с нормозооспермией говорит о возможном присутствии альтернативных защитных механизмов для иммунопротекции сперматозоидов в женском половом тракте. Возможно, сперматозоиды, экспрессирующие FasL, у фертильных мужчин являются теми клетками, которые участвуют в механизме братоубийственной элиминации через апоптоз Fas-экспрессирующих сперматозоидов, т. е. система контроля за качеством сперматозоидов может функционировать не только в течение сперматогенеза, но и по всему мужскому половому тракту. Таким образом, FasL, экспрессирующийся на сперматозоидах, необходим для осуществления обеих функций: для контроля за качеством спермы и для защиты от иммунного наблюдения [13].

Результаты проведенного исследования выявили явные различия в экспрессии маркеров апоптоза Fas и FasL на сперматозоидах фертильных и субфертильных мужчин.

Наблюдаемая экспрессия Fas-антигена, вероятно, произошла еще в период сперматогенеза и выявленные маркированные клетки — как раз те клетки, которые должны были быть устранены в процессе апоптоза, но по каким-то причинам механизмы апоптоза не были закончены, либо были отложены, либо функционировали неправильно [21]. Корреляционный анализ при этом выявил, что часть тех сперматозоидов, которые оценены как активно подвижные у субфертильных пациентов, были маркированы Fas и предрасположены при наличии дополнительных факторов к смерти через Fas-зависимый апоптоз, что подтвердилось положительной корреляцией количества Fas+ клеток с подвижностью.

Положительная корреляция Fas+ клеток с наличием в эякуляте патологических форм сперматозоидов также свидетельствует о том, что эти клетки потенциально уготовлены к гибели по рецепторному (мембранному) пути апоптоза [22], когда сигналы к его запуску поступают извне и опосредованы через Fas-рецепторы.

Таким образом, продемонстрирована достоверная связь между экспрессией рецептора апоптогенного сигнала Fas и качеством спермы. Представленные данные убедительно показывают, что содержание в эякулятах субфертильных мужчин сперматозоидов с маркером апоптоза Fas коррелирует с концентрацией, подвижностью и дефектами морфологии сперматозоидов. Эти факты позволяют считать экспрессию рецептора апоптогенного сигнала на клетках — Fas-фактором, снижающим фертильность спермы.

Выявленные различия в экспрессии белков маркеров апоптоза Fas и FasL на поверхности сперматозоидов фертильных и субфертильных мужчин позволят дополнить диагностический арсенал при исследовании мужской репродуктивной функции и тем самым помочь в выявлении причин нарушения фертильности сперматозоидов. Полученные данные могут также представлять практический интерес при подготовке спермы для вспомогательных репродуктивных технологий.