Подавление ангиогенеза и продукции факторов роста в сочетании с индукцией активности металлопротеиназ в лейомиомах матки после курса терапии улипристалом

Лейомиомы матки (ЛМ) диагностируют у 35-70% женщин репродуктивного возраста. Они служат главной причиной гистерэктомии, и важнейшей задачей является разработка методов их лечения, позволяющих сохранить репродуктивную функцию [1-4]. С 2012 г. арсенал методов предоперационного лечения ЛМ и быстрого купирования менометроррагий перед органосохраняющими операциями миом­эктомии, а в будущем, возможно, и их консервативной терапии пополнился новым пероральным синтетическим селективным модулятором рецепторов прогестерона (РП) - улипристала ацетатом (препарат Эсмия компании «Гедеон Рихтер»). ЛМ - яркий пример прогестеронзависимого патологического процесса. Улипристал оказывает смешанное тканеспецифичное агонистическое - антагонистическое влияние на РП в ЛМ, миометрии и эндометрии, не давая при этом гипоэстрогенного и других негативных побочных эффектов, свойственных, например, агонистам гонадолиберинов. Рандомизированные двойные слепые плацебо-контролируемые исследования (названные PEARL I и II - PGL4001's Efficacy Assessment in Reduction of symptoms due to uterine Leiomyomata - «Оценка эффективности PGL4001 [улипристала ацетата] в уменьшении симптомов, вызванных лейомиомой матки») показали, что трехмесячный курс лечения улипристалом приводит к быстрому прекращению менометроррагий и значительному уменьшению размеров ЛМ без риска развития гиперплазии эндометрия [5-8]. Результаты третьего этапа многоцентровых клинических исследований (PEARL III) продемонстрировали высокую эффективность и безопасность повторных курсов терапии улипристалом. Так, после первого 3-месячного курса аменорея развивалась в среднем через 4 сут у 79% женщин, а объем ЛМ уменьшался на 45% (от 25 до 66%). После четырех 3-месячных курсов частота аменореи достигала 90%, а размеры ЛМ уменьшались на 72%, что позволило у части пациенток отказаться от хирургического вмешательства в связи со значительным и пролонгированным регрессом опухоли [7]. В эндометрии у большинства женщин под влиянием улипристала развиваются обратимые (в течение нескольких недель даже после 4 курсов терапии) доброкачественные изменения, получившие название PAEC (PRM-Associated Endometrial Changes - изменения эндометрия, ассоциированные с применением модуляторов рецепторов прогестерона), лежащие, наряду с ановуляцией, в основе аменореи [5-10].

Молекулярно-биологические механизмы влияния улипристала на ЛМ изучены, главным образом, in vitro. В культуре ткани опухолевых лейомио­цитов ЛМ доказано подавление различными селективными модуляторами РП, в том числе улипристалом, их пролиферативной активности и индукция апоптоза, а также снижение продукции ими разных факторов роста, включая эпидермальный и сосудистый эндотелиальный, а также коллагена в сочетании с повышением синтеза матриксных металлопротеиназ [11-16]. На клиническом материале показано, что курс терапии улипристалом приводит к усилению апоптоза, подавлению пролиферативной и митотической активности клеток ЛМ, причем в большей степени, чем агонист гонадолиберина трипторелин [17, 18]. Однако значительное уменьшение размеров ЛМ при терапии улипристалом, а в этих опухолях строма составляет бо'льшую часть их объема, позволяет предположить его влияние также на ангиогенез и метаболизм экстрацеллюлярного матрикса.

Цель исследования - выяснение молекулярно-биологических механизмов влияния улипристала ацетата на ангиогенез, продукцию факторов роста, а также матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в ЛМ in vivo.

Проведено комплексное гистологическое, иммуноморфологическое и морфометрическое исследования ЛМ, удаленных в ходе миом- и гистерэктомий у 31 пациентки после 3-месячного курса терапии улипристалом (препарат Эсмия, 5 мг в сутки) - основная группа. В группу сравнения вошли 10 женщин без предоперационной гормональной терапии или контрацепции. Больные группы сравнения были сходны с пациентками основной группы по возрасту, клиническим проявлениям, а также размерам, локализации и гистологическому строению ЛМ (простые или обычные ЛМ). В исследование не включали женщин с другими гистологическими вариантами ЛМ, аденомиомами, а также с сочетанной патологией репродуктивной системы и соматическими заболеваниями. Возраст пациенток основной группы составил от 26 до 53 лет (средний возраст 38,25±4,6 года), группы сравнения - от 33 до 48 лет (средний 40,2±4,4 года). По данным ультразвукового исследования (УЗИ) и магнитно-резонансной томографии (МРТ) диаметр доминирующего узла ЛМ в основной группе варьировал от 3 до 11 см (средний 9,1±1,7 см), в группе сравнения - от 1,5 до 7,5 см (средний 4,0±1,9 см). В основной группе у 15 (48%) женщин ЛМ были интрамуральными и интрамурально-субмукозными, у 14 (46%) - интрамурально-субсерозными и у 2 (6%) - субсерозными. В группе сравнения - у 8 (80%) женщин ЛМ были интрамуральными и у 2 (20%) - интрамурально-субмукозными. Клинические симптомы в основной группе были представлены у 28 (90%) женщин менометроррагиями, 3 (10%) были оперированы в целях подготовки к беременности. В группе сравнения у всех пациенток отмечены менометроррагия, симптомы сдавления органов малого таза.

После 3-месячного курса терапии улипристалом у всех женщин основной группы в течение 4-10 дней от начала лечения развилась аменорея (нормальный цикл восстановился в течение 4 нед после завершения лечения), а по данным УЗИ и МРТ диаметр ЛМ уменьшился на 1,0-4,5 см (в среднем на 3,8±0,8 см). Следовательно, объем ЛМ под влиянием улипристала за 3 мес терапии уменьшился в среднем на 38% (от 12 до 54%), что соответствует данным международных исследований PEARL I, II и III [5-7].

Образцы ткани (от 3 до 6) из разных участков каждой ЛМ фиксировали в 10% нейтральном формалине и по общепринятой методике заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону и толуидиновым синим. Для иммуногистохимического исследования гистологические срезы помещали на предметные стекла, покрытые адгезивом (APES-ацетон). Эндогенную пероксидазу в депарафинированных срезах блокировали 3% перекисью водорода. Демаскировку антигенов производили в микроволновой печи в течение 20 мин в 0,1 М растворе цитратного буфера (рH 6,0). Использовали 11 первичных специфических антител: к маркеру эндотелия - CD34 (mouse monoclonal antibody, «Novocastra», Великобритания), сосудисто-эндотелиальному фактору роста - VEGF (rabbit monoclonal antibody, «GeneTex», США); эпидермальному фактору роста - EGF (mouse monoclonal antibody, EGF-10, «Santa Cruz Biotechnology», США), основному фактору роста фибробластов - FGF-2 (rabbit polyclonal antibody, «Santa Cruz Biotechnology», США), трансформирующему фактору роста-β1 - TGF--β1 (rabbit polyclonal antibody, «GeneTex», США), матриксным металлопротеиназам - ММР-2, -10 (rabbit polyclonal antibody, «Spring Bioscience», США), MMP-12 (mouse monoclonal antibody, «Santa Cruz Biotechnology», США), их тканевым ингибиторам TIMP-1, -2, -3 (rabbit polyclonal antibody, «Spring Bioscience», США).

Гистологические срезы инкубировали с первичными антителами в течение 30-60 мин при температуре 37°С (рабочее разведение антисывороток 1:100-1:400). Применяли систему детекции Novolink Polymer Detection System («Leica», Великобритания). Проводили общепринятые отрицательные (с исключением первичных специфических антител) и положительные (с использованием препаратов рака молочной железы) контрольные процедуры на используемые реагенты и ткани при обработке параллельных срезов.

Для оценки продукции факторов роста (VEGF, EGF, FGF-2, TGF--β1), матриксных металлопротеиназ (ММР-2,-10,-12) и их тканевых ингибиторов (TIMP-1,-2,-3) использовали полуколичественный морфометрический метод. Визуально оценивали интенсивность иммуногистохимической реакции в баллах от 0 до 3 (отрицательная, слабая, умеренная и выраженная) в 10 полях зрения при увеличении 400. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программ Microsoft Office Excel 2007 и Statistica for Windows v.6.0. Различия признавались статистически значимыми при p<0,05.

Иммуногистохимическое исследование с маркером эндотелия сосудов CD34 выявило в наблюдениях основной группы по сравнению с группой сравнения выраженную редукцию микроциркуляторного русла ЛМ, причем просвет многих сосудов был неравномерно сужен или, наоборот, расширен (рис. 1, а, в и далее на цветн. вклейке).

Продукция других трех изученных факторов роста (EGF, FGF-2 и TGF-β1) в ЛМ после лечения улипристалом также была значительно (в 2-2,7 раза) снижена по сравнению с опухолями из группы сравнения (см. табл. 1 и рис. 2). Экспрессия EGF, FGF-2 и TGF-β1, как и VEGF, наблюдалась в ЛМ у женщин основной группы, в отличие от опухолей у женщин группы сравнения преимущественно в периваскулярных зонах (рис. 3).

Изучение продукции трех различных матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов выявило, что в ЛМ под влиянием улипристала активируются процессы ферментного лизиса экстрацеллюлярного матрикса. Экспрессия ММР-2 (желатиназы A, коллагеназы типа IV) и ММР-10 (стромелизина-2) в опухолях пациенток основной группы была в 2,5-3 раза выше, чем в ЛМ у женщин группы сравнения (табл. 2, рис. 4, 5, а, б).

Продукция трех изученных тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ (TIMP-1, -2, -3), в ЛМ у женщин основной группы была, напротив, снижена, в среднем в 2,3-2,8 раза по сравнению с опухолями, не подвергшимися влиянию улипристала (см. табл. 2, рис. 4, рис. 6).

Результаты иммуногистохимического исследования позволили объяснить ряд морфологических особенностей ЛМ у женщин основной группы, выявленных гистологическим методом. Так, наряду с участками склероза и гиалиноза были характерны множественные очаги лизиса стромы без изменения рН (без развития метахромазии при окраске толуидиновым синим). Обнаруживались участки коллапса стромы и паренхимы опухоли с феноменом сближения сохранившихся сосудов (рис. 7).

Важно отметить, что во всех наблюдениях основной группы при исследовании биопсийного материала эндометрия после курса терапии улипристалом не было выявлено каких-либо его изменений, кроме (в 67% случаев) типичных для РАЕС, которые регрессировали в течение нескольких недель. Иммуногистохимическое исследование выявило низкую пролиферативную активность (экспрессию Ki-67) и неравномерную - bcl-2 и Bax, не соответствующую физиологическим фазам пролиферации и секреции в эпителии желез и клетках стромы. Это подтверждает опубликованные ранее данные о том, что улипристал не вызывает развития гиперплазии эндометрия, а приводит к возникновению его обратимых доброкачественных специфических изменений, которые гистологически крайне важно, во избежание серьезной ошибки, дифференцировать с гиперплазией эндометрия [5-10].

Таким образом, улипристал оказывает на ЛМ комплексное действие, влияя одновременно на паренхиму, сосуды и строму опухоли, приводя не только к остановке ее роста, но и значительному и, как показано ранее, долговременному, до полугода и более [5-8], уменьшению объема. В предыдущих исследованиях нами была подтверждена индукция апоптоза и обнаружено угнетение пролиферативной и митотической активности клеток ЛМ [17]. Однако уменьшение только объема паренхимы ЛМ не позволяет объяснить значительное, в несколько раз, уменьшение их размеров, так как в простых ЛМ более ⅓ их объема представлено стромой - экстрацеллюлярным матриксом. Кроме того, в росте ЛМ, как и других опухолей, большую роль играют процессы ангиогенеза [1-4]. Проведенное исследование показало, что, как и предполагалось по результатам работ с использованием культур тканей [11-16], улипристал подавляет ангиогенез ЛМ, угнетая прежде всего продукцию VEGF и приводя к редукции сосудистого русла опухоли. Помимо того, обнаружено подавление продукции и других важнейших для ангиогенеза и роста паренхимы и стромы опухоли факторов (EGF, FGF-2 и TGF-β1), что ранее было выявлено in vitro [11-16]. Известно, что EGF и FGF-2 - многофункциональные белки с большим набором эффектов, играют ключевую роль в ангиогенезе, процессах пролиферации и дифференцировки клеток, в частности ЛМ под влиянием прогестерона. FGF-2 оказывает регуляторное, структурное и паракринное воздействие, стимулирует рост эндотелиальных клеток и организацию их в трубчатые структуры, ускоряя ангиогенез, рост новых кровеносных сосудов из уже существующей сосудистой сети. FGF-2 является даже более мощным ангиогенным фактором, чем VEGF. TGF-β1 также оказывает многогранное действие на пролиферацию клеток, процессы ангиогенеза и склероза [12, 19-21].

Обнаруженное повышение продукции ММР в сочетании с подавлением экспрессии их тканевых ингибиторов указывает на то, что улипристал активирует в ЛМ процессы ферментного лизиса (гидролиза) экстрацеллюлярного матрикса и ремоделирования стромы, приводя в итоге к уменьшению ее объема. Гистологически это подтверждается появлением очагов лизиса стромы с сохранением нейтрального рН и коллапса ткани ЛМ с феноменом сближения сосудов. Изученные матриксные металлопротеиназы (ММР-2 - желатиназа А, ММР-10 - стромелизин-2 и ММР-12 - макрофагальная металлоэластаза) относятся к семейству Zn²⁺- и Са²⁺-зависимых эндопептидаз, участвующих в ремоделировании соединительной ткани посредством разрушения ее органических компонентов при физиологических значениях рН. Свое название матриксные металлопротеиназы получили за способность специфически гидролизовать основные белки межклеточного матрикса [22]. В классификации ММР выделяют три группы [23]: ММР секреторного типа (классические, свободные, растворимые) - коллагеназы (ММР-1, -8, -13), желатиназы (ММР-2, -9, -14), стромелизины (ММР-3, -10, -15), матрилизины (ММР-7); ММР, связанные с клеточными мембранами (мембранный тип МТ-ММР-14, -15, -16, -17) и неклассифицированные ММР, не относящиеся к известным подсемействам (ММР-7, -12, -19, -20). ММР обладают относительной субстратной специфичностью: представители подсемейства коллагеназ «ответственны», главным образом, за деградацию коллагена I, II и III типов, желатиназы и стромелизины, расщепляют коллаген IV, V типов, а также эластин, фибронектин, ламинин и желатин. Субстратами для ММР могут быть нематричные компоненты: плазминоген, фибрин, фибронектин, казеин, кор-протеин, предшественники цитокинов (в частности, MMP-2 инактивирует интерлейкин -1β, а ММР-12 - фактор свертывания XII), их активность влияет на процессы апоптоза и пролиферации [24]. Активность ММР зависит от уровня экспрессии их генов и наличия активаторов и тканевых ингибиторов (TIMP-1, -2, -3, -4). ТIМP различаются по их специфическому действию на ММP. Так, TIMP-2 больше подавляет активность ММР-2 [25]. ММР относят к «индуцируемым» ферментам, транскрипция и активность которых подчиняются ряду факторов (стероидные и тиреоидные гормоны, цитокины, факторы роста, химические агенты и др.), в том числе половым гормонам [26-28]. Показано, что присутствие прогестерона и эстрогенов в культуре клеток эндометрия снижает активность ММР, а при их отмене она резко повышается [29, 30]. Прогестерон в наибольшей степени снижает экспрессию ММР в эндометрии, а также увеличивает транскрипцию генов, кодирующих TIMP [31]. Это может служить объяснением обнаруженного эффекта селективного модулятора РП улипристала (ранее выявленного in vitro [12]) in vivo повышать в ЛМ продукцию ММР и угнетать продукцию их тканевых ингибиторов в тесной связи с подавлением выработки факторов роста, процессов ангиогенеза, проапоптотическим и антипролиферативным действием [17, 18].

Таким образом, улипристал вызывает уменьшение объема ЛМ не только вследствие индукции апоптоза клеток опухоли, снижения их пролиферативной и митотической активности, но и благодаря подавлению ангиогенеза, продукции факторов роста (VEGF, EGF, FGF-2, TGF-β1) в сочетании с повышением продукции матриксных металлопротеиназ (MMP-2, -10, -12) и снижением продукции их тканевых ингибиторов (TIMP-1, -2, -3). Это приводит к редукции сосудистого русла, ремоделированию и уменьшению объема экстрацеллюлярного матрикса ЛМ. Одновременное влияние на паренхиматозный компонент, ангиогенез и экстрацеллюлярный матрикс объясняет механизм быстрого, выраженного и пролонгированного уменьшения объема ЛМ под влиянием улипристала. Кроме того, изучение биоптатов эндометрия у женщин после курса терапии улипристалом не выявило каких-либо его изменений, кроме (в 67% наблюдений) типичных для РАЕС с низкой пролиферативной активностью эпителия и клеток стромы, и регрессирующих в течение нескольких недель после окончания лечения.