Антипролиферативное и проапоптотическое действие селективного модулятора рецепторов прогестерона улипристала на лейомиому матки in vivo

Лейомиомы матки (ЛМ), называемые также «фиброидами» (uterine fibroids), представляют собой доброкачественные моноклональные гладкомышечные опухоли. Они диагностируются, по данным разных авторов [1-8], у 20-70% женщин репродуктивного возраста, занимают первое место по частоте среди опухолей женской половой сферы и служат главной причиной проведения гистерэктомии. Важнейшей задачей является разработка сохраняющих репродуктивную функцию органосберегающих хирургических и консервативных методов лечения ЛМ.

ЛМ представляют собой пример прогестеронзависимого патологического процесса. Прогестерон является индуктором их роста за счет повышения пролиферативной активности и подавления апоптоза клеток опухоли [3, 6-11]. В 2012 г. в Европе и России зарегистрирован новый пероральный синтетический селективный модулятор рецепторов прогестерона (РП) - улипристала ацетат (препарат Эсмия компании «Гедеон Рихтер»). Улипристал оказывает смешанное тканево-специфическое агонистическое-антагонистическое влияние на РП в ЛМ, миометрии, эндометрии и гипофизе, не давая при этом побочного гипоэстрогенного эффекта. Рандомизированные двойные слепые плацебо-контролируемые исследования показали, что трехмесячный курс лечения улипристалом приводит у 80% женщин к значительному уменьшению размеров ЛМ и быстрому прекращению мено-, метроррагий без риска развития гиперплазии эндометрия [6, 7, 12, 13]. В эндометрии развиваются обратимые изменения, получившие название PAEC (PRM - Associated Endometrial Changes - изменения эндометрия, ассоциированные с использованием модуляторов РП) [12, 13]. Доказана безопасность и эффективность улипристала при подготовке больных с ЛМ к органосохраняющим операциям (миомэктомии и т.д.), причем в ряде наблюдений [6, 7] в связи с выраженной регрессией опухоли удается избежать хирургического вмешательства.

Молекулярно-биологические механизмы влияния улипристала на ЛМ изучены, главным образом, in vitro. В культуре ткани опухолевых лейомиоцитов ЛМ продемонстрированы подавление пролиферативной активности и индукция апоптоза [3, 14]. На ограниченном клиническом материале показано, что курс терапии улипристалом приводит к усилению апоптоза клеток ЛМ в большей степени, чем агонист гонадолиберина (трипторелин) [9].

Цель исследования - выяснение молекулярно-биологических механизмов влияния улипристала ацетата (Эсмия) на ЛМ in vivo.

Проведено комплексное гистологическое, иммуноморфологическое и морфометрическое исследование 16 удаленных в ходе органосохраняющих миом­эктомий ЛМ у пациенток после курса терапии препаратом Эсмия (5 мг в сутки в течение 3 мес) - основная группа в сравнении с 10 ЛМ после миомэктомии (4 наблюдения) и гистерэктомии (6) у женщин без предоперационной гормональной терапии или контрацепции. Больные основной группы и группы сравнения были сопоставимы по возрасту, клиническим проявлениям, а также размерам, локализации и гистологическому строению ЛМ (простые или обычные ЛМ). Из исследования были исключены наблюдения с другими гистологическими вариантами ЛМ, аденомиомами, а также случаи сочетанной патологии репродуктивной системы и соматических заболеваний. Возраст пациенток основной группы составил 27-42 года (средний - 35,5±5,5 года), группы сравнения - 33-48 лет (средний - 40,2±4,4 года). Диаметр доминирующего узла ЛМ в основной группе варьировал от 5 до 11 см (средний диаметр 9,2±1,7 см), в группе сравнения - от 1,5 до 7,5 см (средний - 4,0±1,9 см). В основной группе 8 (50%) ЛМ были интрамуральными и интрамурально-субмукозными, 7 (44%) - интрамурально-субсерозными и 1 (6%) - субсерозной. В группе сравнения 8 (80%) ЛМ были интрамуральными и 2 (20%) - интрамурально-субмукозными. Клинические симптомы в основной группе были представлены в 13 (81%) наблюдениях мено-, метроррагиями, 3 (19%) женщины были оперированы в целях подготовки к беременности. В группе сравнения у всех пациенток отмечены мено-, метроррагия, симптомы сдавления органов малого таза.

После 3-месячного курса терапии улипристалом у всех женщин основной группы диаметр ЛМ уменьшился на 1,5-3 см (в среднем - на 3,0±0,7 см) и в течение 7-10 дней от начала лечения развилась аменорея (нормальный цикл восстановился в течение 4 нед после завершения лечения).

От 3 до 6 образцов ткани из разных участков каждой ЛМ фиксировали в 10% нейтральном формалине и по общепринятой методике заливали в парафин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону. В ходе иммуногистохимического исследования использовали 7 первичных специфических моноклональных антител: к рецепторам эстрогенов (РЭ), РП, маркеру пролиферации, ядерному белку Ki-67, маркеру митозов, ядерному белку фосфогистону Н3, маркеру апоптоза, активной (расщепленной) каспазе-3, ингибитору апоптоза bсl-2, индуктору апоптоза Вах (Leica, UK, «Cell Marque», США, «GeneTex», США). Применяли систему детекции Novolink Polymer Detection System (Leica, UK) со стандартным контролем.

Для оценки экспрессии Ki-67, фосфогистона Н3 и активной каспазы-3 подсчитывали процент клеток с положительной реакцией (на 1000 клеток в 10 репрезентативных полях зрения при ×400). Результаты реакций с антителами к РЭ и РП, bcl-2 и Bax оценивали с помощью полуколичественного морфометрического метода, вычисляя коэффициенты экспрессии (КЭ) [15]. КЭ рассчитывали для каждого наблюдения по формуле: КЭ = Σ(Б·П)/100, где Б - интенсивность окраски в баллах (от 0 до 3), П - процент окрашенных ядер или клеток для каждого значения Б (изучали по 1000 клеток в 10 полях зрения с наиболее выраженной реакцией при ×400). Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программ Microsoft Office Excel 2007 и Statistica for Windows v.6.0. Различия признавались статистически значимыми при p<0,05.

Иммуногистохимическое исследование продемонстрировало в ЛМ основной группы тенденцию к повышению экспрессии РП ядрами опухолевых лейомиоцитов при сохранении РЭ (рис. 1, а на цв. вклейке).

В ЛМ основной группы выявлено выраженное и статистически достоверное снижение в 2,2 раза пролиферативной (экспрессии Ki-67) и в 6 раз - митотической (экспрессии фосфогистона Н3) активности опухолевых лейомиоцитов в сочетании со значительной (в 4 раза) индукцией апоптоза (экспрессии активной каспазы-3) (см. рис. 1, б, в, г на цв. вклейке). Так, в ЛМ основной группы Ki-67 экспрессировали 0,34±0,17% опухолевых клеток, фосфогистон Н3 - 0,02±0,02%, активную каспазу-3 - 0,74±0,15%, в группе сравнения - соответственно 0,73±0,27, 0,12±0,11 и 0,18±0,72% (р<0,05) (см. таблицу, см. рис. 2).

Представляет интерес обнаруженное лишь незначительное и статистически недостоверное снижение экспрессии ингибитора апоптоза bcl-2 и повышение экспрессии индуктора апоптоза Вах (см. рис. 1, д, е). КЭ bcl-2 в клетках ЛМ основной группы составил 1,48±0,24, в группе сравнения - 1,56±0,18. Показатели КЭ Вах были равны соответственно 1,05±0,13 и 0,93±0,07 (см. таблицу, см. рис. 2). В результате минимальное увеличение индекса Bax/bcl-2 (с 0,6 до 0,7) не соответствовало отмеченному четырехкратному росту апоптоза клеток ЛМ основной группы после терапии улипристалом.

Результаты гистологического исследования соответствовали выявленным молекулярно-биологическим изменениям. Они показали, что, несмотря на свойственный ЛМ полиморфизм строения даже в пределах одного гистологического варианта (в частности, простых ЛМ, включенных в исследование) [16], в наблюдениях основной группы были более выражены склероз и гиалиноз стромы и периваскулярных зон роста с сужением просвета артерий и редукцией микроциркуляторного русла, а также псевдокапсулы опухолей (рис. 3, а-д на цв. вклейке).

Кроме того, в сходных по строению участках ЛМ основной группы и группы сравнения обращал на себя внимание заметно меньший размер опухолевых лейомиоцитов и их ядер в опухолях основной группы (см. рис. 3, е на цв. вклейке), что позволяет предположить уменьшение степени гипертрофии клеток ЛМ после курса терапии улипристалом.

Таким образом, гистологическое исследование выявило определенные различия между сходными по типу и локализации ЛМ у близких по возрасту женщин основной группы и группы сравнения. Полученные результаты могут прояснить механизмы блокады роста и уменьшения размеров таких опухолей под влиянием улипристала. Гистологическое строение ЛМ после курса терапии улипристалом становится сходным с таковым медленно растущим ЛМ и изменениями таких опухолей в постменопаузе [1-3, 16]. Эти изменения неспецифичны, но указывают на определенные нарушения продукции экстрацеллюлярного матрикса и снижение пролиферативной функции клеток ЛМ, которые до лечения отличались быстрым ростом. Важно также отметить меньшие размеры опухолевых лейомиоцитов в ЛМ основной группы. Модуляция РП улипристалом, по-видимому, уменьшает степень гипертрофии клеток ЛМ. Указанные особенности гистологического строения ЛМ позволяют объяснить остановку роста и уменьшение их размеров под влиянием терапии улипристалом.

Иммуногистохимическое исследование продемонстрировало молекулярно-биологические основы действия селективного модулятора РП улипристала на клетки ЛМ. Улипристал подавляет пролиферативную и митотическую активность в сочетании с индукцией апоптоза опухолевых лейомиоцитов, что подтверждает данные, полученные ранее в экспериментах in vitro и результаты изучения активности процессов апоптоза клеток ЛМ in vivo [3, 14]. Такое прямое или опосредованное пара- и аутокринными механизмами влияние улипристала на клетки опухоли объясняет гистологические особенности строения ЛМ после курса терапии с малоактивными периваскулярными зонами роста и признаками нарушения продукции экстрацеллюлярного матрикса опухолевыми сейомиоцитами. Уменьшение степени гипертрофии опухолевых лейомиоцитов также играет роль в быстром, иногда значительном, уменьшении объема опухолевого узла.

Обнаруженная тенденция к повышению экспрессии РП клетками ЛМ после терапии улипристалом, возможно, представляет собой компенсаторный процесс.

Несмотря на четырехкратное повышение активности процессов апоптоза клеток ЛМ в наблюдениях основной группы, обнаружено лишь незначительное и статистически недостоверное снижение экспрессии ингибитора апоптоза bcl-2 и повышение - индуктора апоптоза Вах. В результате индекс Bax/bcl-2 увеличивается минимально, и необходимы дальнейшие исследования для выяснения механизмов выраженной индукции апоптоза улипристалом.

Таким образом, молекулярно-биологические механизмы подавления роста и уменьшения размеров ЛМ под влиянием нового селективного модулятора РП улипристала заключаются в снижении пролиферативной и митотической активности клеток опухоли в сочетании с индукцией их апоптоза и нарушениями продукции экстрацеллюлярного матрикса, а также уменьшением степени их гипертрофии. Обнаруженная тенденция к повышению экспрессии РП опухолевыми клетками представляет собой, вероятно, компенсаторный процесс. Сохранение высокого уровня экспрессии bcl-2 в сочетании с незначительным повышением экспрессии Вах при выраженной индукции апоптоза позволяет предположить влияние улипристала на различные пути его регуляции.