Проблема снижения перинатальных потерь, несмотря на несомненные успехи в ее решении, остается весьма актуальной. Поэтому вопросы предгравидарной подготовки, совершенствования методов обследования женщины во время гестации, прогнозирования и диагностики патологии беременности с учетом современных представлений о молекулярных механизмах ее развития требуют дальнейшего развития. Среди факторов, осложняющих беременность и нарушающих нормальное развитие плода, особое место принадлежит недостаточности плаценты, сопровождающейся различными изменениями метаболизма в этом органе и, как следствие, модификацией взаимосвязей во всей системе мать—плацента—плод. Функциональная полноценность плаценты во многом зависит от экспрессии плацентарных белков различных классов, играющих ключевую роль во всех клеточных процессах [1]. В последнее время большое внимание в молекулярной биологии и медицине уделяется белкам хроматина, исключительно важным для формирования структуры (образование скелета хромосом, «цементирование» молекул ДНК друг с другом) и регуляции функции (поддержание матричной активности ДНК и интенсивности синтеза РНК) генов [2, 3]. Нарушение экспрессии белков хроматина может приводить к развитию патологических состояний, в связи с чем изучение их состава и свойств необходимо для понимания молекулярных основ патогенеза и выбора маркеров осложненной беременности. Однако до настоящего времени сведения о продукции этих белков в плаценте, а также их посттрансляционных изменениях, влияющих на основные ядерные функции, весьма малочисленны [4].

В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явилось изучение гистонов, негистоновых белков хроматина, их посттрансляционных модификаций и транскрипционной активности ядерного фактора NF-κB (nuclear factor κB) в плаценте при физиологической беременности и осложненной плацентарной недостаточностью (ПН).

В проспективное исследование были включены 47 беременных в возрасте 24—32 лет (средний возраст 26,3±0,4 года), в том числе у 21 беременность и роды протекали без осложнений (контрольная группа), у 26 — беременность осложнилась ПН субкомпенсированной формы (основная группа), верифицированной после родов по данным микроскопического исследования последа. Критериями при постановке диагноза служили результаты комплексного обследования, включающего гормональные, ультразвуковые, допплерометрические исследования, определение специфических плацентарных изоферментов щелочной фосфатазы и глутаматдегидрогеназы [5]. По возрасту, индексу массы тела, наступлению менархе, регулярности цикла, паритету беременности и родов, экстрагенитальной и гинекологической патологии женщины обеих групп были сопоставимы. Критериями исключения из исследования являлись декомпенсированные формы соматических заболеваний, многоплодная беременность, декомпенсированная ПН, антенатальная гибель плода, отсутствие информированного согласия пациенток на участие в исследовании. Для объективности полученных данных деление на группы проводили до биохимического исследования плаценты.

Материалом исследования служили плаценты, взятые сразу после родов в сроки беременности 39—40 нед при соблюдении холодового режима. Из ткани плаценты стандартным методом дифференциального ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы при 12 000 g выделяли осадок, который вновь ресуспендировали в более концентрированном растворе сахарозы, содержащей хлорид калия, и после повторного центрифугирования при 15 000 g выделяли ядра. Чистоту фракции определяли микроскопически. Из ядер после изоосмотического лизиса, соответствующей многоступенчатой экстракции и дифференциального центрифугирования выделяли общие гистоны и негистоновые белки хроматина [6]. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле общие гистоны и негистоновые белки разделяли на отдельные фракции. ДНК-связывающую активность субъединицы р65 транскрипционного фактора NF-κB в околоплодных водах определяли с использованием набора фирмы «Cayman Chemical» (США) и выражали в оптических единицах (опт.ед.) на 1 мг общего белка.

Циклонуклеотидзависимое фосфорилирование белков хроматина оценивали по включению в них [γ-32P] АТФ, добавляя в субстратные смеси цАМФ или цГМФ, при определении активности соответствующих протеинкиназ (цАМФ-ПК и цГМФ-ПК).

Статистическую обработку осуществляли с использованием лицензионного пакета программ Statistica (версия 6.0. фирмы «StatSoft. Inc.»). Результаты оценивали как статистически значимые при p<0,05.

Результаты исследований представлены в таблице.

Относительное содержание плацентарных фракций гистонов от общего их уровня при физиологической беременности составляет для Н1 — 18%, Н2α — 23%, Н2β — 16%, Н3 — 24%, Н4 — 19%.

При беременности, осложнившейся ПН, содержание белков хроматина в плаценте снижается относительно величин при физиологической беременности. Общей уровень гистонов снижен на 25%, а негистоновых белков — на 35,2%.

Из 5 фракций гистонов в наибольшей степени при ПН снижен уровень Н1 и Н2α — на 34 и 41% соответственно. В меньшей степени (на 18%) снижается содержание Н2β. Поскольку максимально отличающаяся фракция Н2α характеризуется высоким содержанием аргинина, интересно отметить, что, как показали ранее проведенные нами исследования [8], содержание аргинина в плаценте при ПН значительно уменьшается. Дефицит аргинина может способствовать снижению экспрессии этой фракции гистонов, в значительной степени регулирующей процессы репрессии и дерепрессии генов [9, 10].

Что касается негистоновых белков, то содержание 4 из 9 выделенных фракций, на долю которых приходится 56% от общего уровня этих белков на 27—41% ниже, чем аналогичные контрольные величины, концентрация остальных 5 почти не отличается от показателей при физиологической беременности. На долю негистонов в плаценте приходится 25—30% от общего количества белков. Поэтому снижение уровня этого класса протеинов будет весьма существенно влиять на функциональную активность хроматина, учитывая прежде всего их участие в подготовке тканей к митозу, способность дерепрессировать матричную активность ДНК [11]. Кроме того, часть этих белков обладает активностью протеинкиназ, что расширяет их функциональные возможности [12].

Изменение состава ядерных белков в связи с их участием в регуляции матричной активности хроматина отражается на интенсивности синтеза нуклеиновых кислот в плаценте. Содержание РНК и ДНК в плаценте при ее функциональной недостаточности снижается, сопровождаясь повышением количества их структурных компонентов: аденина, ксантина и гуанина [8]. Кроме того, снижение уровня негистоновых белков, являющихся акцепторными участками хроматина для стероид-рецепторных комплексов, может способствовать гормональному дисбалансу в фетоплацентарной системе.

Регуляторные функции белков хроматина определяются не только интенсивностью экспрессии, т.е. количеством, но и качественными характеристиками. В связи с этим мы изучили возможность модификации их структуры, а именно посттрансляционное фосфорилирование под действием циклонуклеотидзависимых протеинкиназ, во многом обеспечивающее их регуляторные свойства. Последнее осуществляется путем переноса фосфатного остатка молекулы макроэрга на определенные аминокислотные остатки в молекуле белка.

При физиологической беременности активность фосфорилирования негистоновых белков хроматина под действием цАМФ-ПК превышает аналогичную реакцию, катализируемую цГМФ-ПК, в случае гистонов имеет место противоположная ситуация. В то же время для негистоновых белков, по сравнению с гистонами, обнаружена более выраженная интенсивность обоих типов нуклеотидзависимого фосфорилирования, что свидетельствует о субстратной специфичности этой посттрансляционной модификации и возможных различиях ее последствий для разных белков.

При ПН активность фосфорилирования снижается для гистонов на 24 и 18% в зависимости от структуры циклонуклеотида. Степень снижения фосфорилирования негистоновых белков при осложненной беременности более выражена (очевидно, в результате их повышенной лабильности) и составляет 32 и 24% соответственно. Такое изменение фосфорилирования гистонов и негистоновых белков, несомненно, может иметь серьезные последствия для функционирования плаценты. Прежде всего это связано с тем, что данные белки являются регуляторами биологической активности ДНК (репликации и транскрипции) и, следовательно, пролиферативных процессов, высокая интенсивность которых характерна для плацентарной ткани [3, 7]. Возможность отрицательного воздействия выявленной динамики фосфорилирования белков хроматина подтверждается фактом прямой зависимости между уменьшением скорости синтеза РНК, активности РНК-полимеразной реакции и изменениями, происходящими при модификации первичной, а также вторичной структур гистонов.

Согласованная работа генома зависит не только от описанных белков хроматина, но и от других регуляторных полипептидов, обладающих функциями транскрипционных модуляторов, к числу которых относится NF-κB [13].

Полученные данные свидетельствуют о повышении в плаценте при ее функционально-метаболической недостаточности ДНК-связывающей активности NF-κB в среднем на 16%. Разнообразные регуляторные функции NF-κB, участвующего в транскрипции генов, ответственных за синтез цитокинов, белков адгезии, апоптоза и др. [14, 15], позволяют полагать, что нарушение его активности приводит к дальнейшим существенным сдвигам в метаболических процессах плаценты.

В ранее проведенных нами исследованиях изменение активности NF-κB при ПН установлено и в околоплодных водах [16], что, вероятно, свидетельствует о системном характере модификации этого фактора при данном осложнении беременности.

Таким образом, результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что развитие ПН происходит на фоне изменений интенсивности синтеза и структурных модификаций ядерных белков. Данные изменения, с учетом генетических функций белков хроматина, могут служить первичными звеньями в цепи нарушений метаболизма плаценты и фетоплацентарного комплекса в целом.